化学发光法检测传染病

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1、化学发光法快速检测传化学发光法快速检测传染病染病 更灵敏、更特异、更准确更灵敏、更特异、更准确放免酶联免疫化学发光荧光免疫60年代70年代80年代90年代免疫标记技术发展免疫标记技术发展国产进口酶促化学发光直接化学发光直接化学发光 化学发光技术的优势与应用前景化学发光技术的优势与应用前景.敏感度高，(10-21mol/L)超过酶免，荧光免疫等方法.精密度，准确度超过放免，酶免，荧光免疫等方法.试剂稳定，无放射性，污染或生物毒性；.测定耗时短，方便快速提供结果报告；.测定项目齐全；已发展成全自动的测定系统。包被微粒子包被微粒子包被磁珠包被磁珠包被微孔包被微孔包被试管包被试管包被技术的发展包被技术

2、的发展-磁微粒子磁微粒子包被磁微粒包被磁微粒 标记异鲁米诺标记异鲁米诺Eg:双抗夹心法分析模式双抗夹心法分析模式 磁微粒子上包被的抗体与待检测抗原及异鲁米诺标记抗体结合 提升检测功能灵敏度 增加检测线性范围 比吖啶酯更稳定 延长试剂效期微粒包被微粒包被液相反应液相反应磁微粒、直接化学发光反应反应充分速度更快酶标板，板式磁微粒，纳米级，均相CLIA板式载量微粒子化学发光法抗体载量优势微粒子化学发光法抗体载量优势分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入激发液激发液产生产生信号信号信号信号检测检测微粒子化学

3、发光原理微粒子化学发光原理磁性微粒子及其分离技术磁性微粒子及其分离技术磁性微粒子技术的优点：快速分离结合相与游离相 提高与Ag或Ab包被亲和力 提高接触表面积/反应容量比例，实现微量分析 不需要抗体分离步骤，杜绝干扰与交叉反应 允许共价耦合反应，因此可以检测大/小分子的各种物质成分 能应用各种分析设计与反应模式，扩大应用范围 如：夹心法，竟争法，抗体检测法等 利于检测自动化与微量分析v 磁微粒子直接化学发光是最新一代免疫检测新技术最新一代免疫检测新技术v 具有液相、快速、灵敏、准确液相、快速、灵敏、准确的特点v 通过多中心的临床评估，基本上验证了LICA在乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、肿瘤标志物、甲

4、状腺功能等项目的临床可用性v 多家临床试验显示产品的质量不亚于进口的雅培、罗氏和西门子等厂家的产品媲美。v 1）磁性微粒子技术：便于分离，反应均匀，提高灵敏度v 2）泉涌内外壁清洗技术：最小的交叉污染率v 3）试剂盒盖设计：减少人工操作误差和交叉污染，避免试剂挥发影响结果准确性v 4）试剂冷藏系统：保证在仪器操作的过程中试剂能够一直保持稳定v 5）磁性分离技术：保证了清洗效率，对于灵敏度要求极高的标记免疫分析是十分关键的技术技术 雅培雅培 免疫项目免疫项目甲状腺功能甲状腺功能甲状腺素三碘甲状腺原氨酸游离甲状腺素游离三碘甲状腺原氨酸促甲状腺素性腺激素性腺激素人绒毛膜促性腺激素催乳素雌二醇卵泡刺激

5、素黄体生成素孕酮睾酮肿瘤标志物肿瘤标志物甲胎蛋白癌胚抗原前列腺特异性抗原游离前列腺特异性抗原糖类抗原125糖类抗原15-3糖类抗原19-92微球蛋白铁蛋白神经元特异性烯醇化酶人钙结合蛋白肿瘤相关抗原72-4鳞状上皮癌相关抗原细胞角蛋白CYFRA 21-1心血管及心肌标志物心血管及心肌标志物N末端脑钠肽肌钙蛋白肌酸激酶同工酶C反应蛋白心肌脂肪酸结合蛋白脂蛋白相关磷脂酶A2髓过氧化物酶肌红蛋白肝纤维化四项肝纤维化四项透明质酸型前胶原N端肽型胶原蛋白层粘连带白传染病传染病乙型肝炎病毒前S1抗原乙型肝炎病毒e抗体乙型肝炎病毒e抗原乙型肝炎病毒核心抗体乙型肝炎病毒表面抗体乙型肝炎病毒表面抗原丙型肝炎抗体

6、（HCV）梅毒抗体（TP）人类免疫缺陷病毒抗体糖代谢类糖代谢类胰岛素C-肽全自动、管式、直接化学发光法全自动、管式、直接化学发光法 -特异性强、性能稳定特异性强、性能稳定 超长时间无人值守超长时间无人值守 （1）试剂区）试剂区15个试剂位，个试剂位，（2）样本区）样本区12 12=144 个样本位个样本位 （3）码垛区一次性装载）码垛区一次性装载720个反应杯个反应杯 测试中可随时添加，随时替换测试中可随时添加，随时替换真正的急诊功能，急诊样本，随到随测。测试速度高达220测试/小时 原试管上样，无需倒管。全封闭反应舱，有效减少外界环境干扰和污染全中文软件，图标式界面，操作更简便综合测试成本低

7、 管式、微粒子包被技术，反应速度更快，结果更准确。管式、微粒子包被技术，反应速度更快，结果更准确。v ELISA法检测乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照法检测乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照2010年年药药典典规定反应时间至少要规定反应时间至少要2小时小时30分钟；而全自动微粒子化学发光分钟；而全自动微粒子化学发光试剂则不到试剂则不到30分钟即可完成。分钟即可完成。v 稳定性更好稳定性更好v 特异性更好特异性更好 大部分国际一流厂家也都采用直接发光法：大部分国际一流厂家也都采用直接发光法：罗罗 氏氏西门子西门子雅雅 培培.传染病试剂传统酶免法和微粒子化学发光法对比传染病试剂传统酶免法和微粒子

8、化学发光法对比方法学项目传统酶免法微粒子发光法分析敏感度特异性精密度分析敏感度特异性精密度HBsAgadr 0.1IU/mLadw 0.1IU/mLay 0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/313.21%adr 0.1IU/mLadw 0.1IU/mLay 0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/38.03%HBsAb10 mIU/mL(-/-)20/2012.05%10 mIU/mL(-/-)20/207.45%HBeAg1#1:642#1:1283#1:32(-/-)15/15(+/+)9/1012.04%1#1:642#1:1283#1:32(-/-)15/15(

9、+/+)10/108.03%HBeAb1#1:322#1:643#1:64(-/-)15/15(+/+)9/1012.31%1#1:322#1:643#1:64(-/-)15/15(+/+)10/108.20%HBcAb1#1:1282#1:1283#1:256(-/-)15/15(+/+)14/1514.03%1#1:1282#1:1283#1:256(-/-)15/15(+/+)15/1510.34%HCVL1、L2阳性，L3阴性，L4阴性(-/-)29/30(+/+)29/3010.05%L1、L2阳性L3阳性，L4阴性(-/-)30/30(+/+)30/307%HIVS1,S2阴性,S

10、3,S4,S5,S6阳性(-/-)18/20(+/+)20/2014.34%S1阴性,S2,S3,S4,S5,S6阳性(-/-)20/20(+/+)20/2010%TPL1、L2阳性，L3阴性，L4阴性(-/-)20/20(+/+)10/1011.26%L1、L2阳性L3阳性，L4阴性(-/-)20/20(+/+)10/107.98%参比试剂：雅培参比试剂：雅培I2000乙肝灵敏度特异性符合率HBsAg97.92%100%99.78%Anti-HBs95.98%97.38%96.69%hiv95.24%100%99.59%Anti-HBe90.77%97.21%95.36%Anti-HBc91

11、.54%98.9%94.48%试剂性能多中心临床评估（乙肝）试剂性能多中心临床评估（乙肝）免疫测定试剂的关键点免疫测定试剂的关键点v 作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键和总体表现的关键 如何选择好一个抗体如何选择好一个抗体(单克隆或多克隆单克隆或多克隆)去检测一个被检去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它代谢产物有交叉反应物质，而不与非常相似结构的其它代谢产物有交叉反应,或着是一些没有临床意义的分解产物等，这是分析设计或着是一些没有临床意义的分解产物等，这是分析设计的重点中之重点。的重点中之重点。批内、批间的分

12、析重现性批内、批间的分析重现性。AFPHBsAg4.50%1.79%4.91%2.14%HCV12345MeanSDCV批内86.1186.3688.4087.9086.4386.271.551.79%批间74.59 73.63 69.64 71.90 71.96 71.01 3.20 4.50%HBsAg12345MeanSDCV批内72.59 71.25 76.50 75.05 78.03 76.61 1.642.14%批间0.22 0.22 0.23 0.22 0.23 0.23 0.01 4.91%批内批间微粒子化学发光试剂的精密度微粒子化学发光试剂的精密度相关性相关系数线性系数HIV

13、显著相关0.990.98HCV显著相关0.930.99参比试剂：雅培参比试剂：雅培试剂性能多中心临床评估试剂性能多中心临床评估相关性相关系数线性系数HIV显著相关0.970.92HBsAg显著相关0.960.95N=500，参比试剂：雅培I2000试剂性能多中心临床评估试剂性能多中心临床评估 丙型肝炎抗体诊断试剂丙型肝炎抗体诊断试剂丙肝病毒复杂的基因结构：决定了抗体谱的差异，从而为丙肝抗体检测敏感度的提高带来了困难。丙肝诊断试剂目前存在的问题丙肝诊断试剂目前存在的问题v1、灰区标本的困惑、灰区标本的困惑v2、阳性标本的漏检、阳性标本的漏检问题形成的技术原因问题形成的技术原因-灰区的形成灰区的形

14、成1、重组抗原的原因、重组抗原的原因 （1）融合蛋白）融合蛋白 （2）大肠杆菌杂蛋白）大肠杆菌杂蛋白2、第二抗体的非特异反应、第二抗体的非特异反应 （1）酶标抗体对固相载体的直接吸附）酶标抗体对固相载体的直接吸附 酶标二抗对于丙肝抗体是非特异的，和各种人酶标二抗对于丙肝抗体是非特异的，和各种人IgG均能反应均能反应结合。结合。（2）个别标本中）个别标本中IgG浓度过高浓度过高 多聚体的混合：多聚体的混合：E-E、E-Ab、E-Ab-E、E-Ab-E-Ab，既，既引起本底背景，又阻遏抗原抗体反应引起本底背景，又阻遏抗原抗体反应 问题形成的技术原因问题形成的技术原因-阳性标本的漏检阳性标本的漏检1

15、、关于灵敏度的两个概念、关于灵敏度的两个概念 （1）分析灵敏度）分析灵敏度 决定因素：决定因素：a.单个抗原决定族的抗原性强弱。单个抗原决定族的抗原性强弱。b.试剂盒的信号放大能力试剂盒的信号放大能力 （2）流行病学敏感度）流行病学敏感度 决定因素：决定因素：a.抗原片段的种类是否齐全。抗原片段的种类是否齐全。b.是否含构像抗原。是否含构像抗原。c.分析灵敏度的高低。分析灵敏度的高低。CE1 E2/NS1NS2NS3 NS4a NS4b NS5aNS5b丙型肝炎病毒的基因结构丙型肝炎病毒的基因结构ELISA-1st RIBA-1stELISA-2stRIBA-2stELISA-3stRIBA-

16、3stC22-3C22-3NS5NS5C100C1005-1-1C33CC100C33CC1005-1-1C33CC33CC100C1005-1-1 2、抗原片段种类不全3、包涵体抗原，抗原性弱、包涵体抗原，抗原性弱4、缺乏构像表位、缺乏构像表位5、原核表达分子量小，抗原表位有限、原核表达分子量小，抗原表位有限6、抗原非糖基化，稳定性差、抗原非糖基化，稳定性差7、信号放大能力有限、信号放大能力有限8、固相载体形成的空间位阻、固相载体形成的空间位阻问题形成的技术原因问题形成的技术原因-阳性标本的漏检阳性标本的漏检新型丙肝化学发光试剂的关键技术新型丙肝化学发光试剂的关键技术1、包被和标记实现双特异

17、，以降低假阳性、包被和标记实现双特异，以降低假阳性率，并提高分析敏感度。率，并提高分析敏感度。2、通过整体系统优化，进一步扩大阴阳反、通过整体系统优化，进一步扩大阴阳反差，使结果判读泾渭分明。差，使结果判读泾渭分明。新型丙肝化学发光试剂技术策略新型丙肝化学发光试剂技术策略-灰区的解决灰区的解决1、酵母真核表达抗原，高效减少灰区标本、酵母真核表达抗原，高效减少灰区标本 与与Pichia pastoris 检测国标检测国标国标品表达载体N2N4N24P1P5P21大肠杆菌（原核表达）0.2600.1490.2350.7422.6590.706毕赫酵母（真核表达）0.0600.0140.0171.7

18、362.8331.619Anti HCV重组重组 NS3 NS3 抗原抗原v NS3 HCVNS3 HCV病毒的最重要的抗原病毒的最重要的抗原v 通过通过酵母真核系统酵母真核系统成功的表达成功的表达NS3NS3抗原抗原,多重折叠以达到多重折叠以达到高度的免疫活性高度的免疫活性 v 高纯度高纯度;易于直接标记易于直接标记2、针对、针对Fab端的单特异性抗体标记物端的单特异性抗体标记物一般二抗一般二抗和和单特异抗体单特异抗体的对比的对比 国标二抗类型P27L3N2N4N18N24L4一般单抗0.5600.1600.2300.1620.0710.2140.065单特异抗体0.8920.3210.06

19、50.0430.0140.1020.009 3、板式固相载体升级为管式磁微粒子包被、板式固相载体升级为管式磁微粒子包被 包被量更富足包被量更富足 管式液相反应更充分管式液相反应更充分 更有效的解决空间位阻效应更有效的解决空间位阻效应 4、光信号检测，提高信噪比、光信号检测，提高信噪比 信号放大代替靶标放大，减少靶标放大带来的非特异性信号放大代替靶标放大，减少靶标放大带来的非特异性反应，远远大于反应，远远大于ELISA的信噪比。的信噪比。新型丙肝化学发光试剂新型丙肝化学发光试剂-降低漏检率降低漏检率1、在、在CORE、NS3、NS4、NS5的基础上增加了的基础上增加了E1区区，保证抗原片段的齐全

20、，保证抗原片段的齐全2、pichia pastoris表达系统带来以下优势表达系统带来以下优势 （1）非包涵体而可溶性表达，抗原性强）非包涵体而可溶性表达，抗原性强 （2）因糖基化而提高稳定性）因糖基化而提高稳定性 （3）分子量大，抗原表位丰富）分子量大，抗原表位丰富 （4）具有构像抗原表位，而提高检出率）具有构像抗原表位，而提高检出率3、磁微粒子标记抗原增加抗原抗体的反应强度、磁微粒子标记抗原增加抗原抗体的反应强度新型丙肝化学发光试剂新型丙肝化学发光试剂检测国家参考品符合率对比检测国家参考品符合率对比方法学阳性符合率 阴性符合率 最低减出限ELISA30/3029/303/4CLIA30/3

21、030/303/4新型双特异丙肝化学发光诊断试剂新型双特异丙肝化学发光诊断试剂临床验证报告临床验证报告方法学真阳性检出率假阳性率酶免试剂146/15019/2000新型双特异150/1503/2000丙肝化学发光试剂临床对比试验报告丙肝化学发光试剂临床对比试验报告对照试剂：雅培对照试剂：雅培I2000SR试验单位：包头市中心医院试验单位：包头市中心医院雅 培总计阳性阴性威高阳性404阴性11314总计51318NO。雅培CUTOFF=18000威高CUTOFF=5040RLUscoRLUsco17200.0415970.317225200.1420720.411318000.117490.34

22、7412600.0717230.342514400.0818750.372618000.1018790.373721600.1223130.45985400.0315120.30099000.0516170.321107200.0416020.3181110800.0618390.365125400.0315220.302137200.0416170.32114340201.8939410.7821522644012.5822200644.04916340201.8922654844.951722644012.585488610.89181382407.6811823823.46RIBA试验结

23、果：阴性。定性检测项目结果判读定性检测项目结果判读-有反应性和无反应性有反应性和无反应性v 定性项目一般以阴阳性作为结果判断的基础。v 阴阳性判读基于量化的结果，主观进行阴阳性的定义。v 真正的确认的阴阳性需要通过金标准测量方法才能确证。v HCV的确证实验RIBA（重组免疫印迹法）v HIV的确证实验Western-Blot（蛋白质印迹法）v 感染初期，可能使用确证实验也无法得出准确的阴阳性结论。v 检验方法的局限性，使用有反应性和无反应性来评估该样本针对该检测方法的检测结果。v 半定量检测，半定量检测，通过病员的动态随访，相隔一定时间再行检测，可通过可通过S/CO值的变化程度来进行确证值的

24、变化程度来进行确证。高特异高特异u经典免疫学原理，单克隆抗体技术经典免疫学原理，单克隆抗体技术u大分子采用夹心法分析大分子采用夹心法分析u小分子采用竞争法分析小分子采用竞争法分析u专利的磁性分离技术专利的磁性分离技术高灵敏高灵敏u采用最灵敏、最稳定的直接发光级联放大系统采用最灵敏、最稳定的直接发光级联放大系统u采用最持久最稳定的发光剂采用最持久最稳定的发光剂ABEI ABEI u采用磁性微粒子技术，扩大包被面积采用磁性微粒子技术，扩大包被面积高稳定高稳定u发光信号稳定，持续发光信号稳定，持续u高质量试剂高质量试剂,无需预处理无需预处理u稳定，持久的标准曲线，有效期长稳定，持久的标准曲线，有效期长u机上试剂冷藏系统，试剂有效期长机上试剂冷藏系统，试剂有效期长u胶膜试剂盒，确保试剂稳定胶膜试剂盒，确保试剂稳定高准确高准确u超灵敏光电倍增管检测发光信号超灵敏光电倍增管检测发光信号u发光发光3 3秒内完成，原位检测秒内完成，原位检测u泉涌式内外壁清洗系统，泉涌式内外壁清洗系统，严格防止交叉污染(1ppm)v降低诊断成本，惠及民生降低诊断成本，惠及民生v全自动操作，重复性好，易于标准化全自动操作，重复性好，易于标准化v高特异性、高灵敏度，避免漏检误诊高特异性、高灵敏度，避免漏检误诊小结小结全自动微粒子化学发光检测优势全自动微粒子化学发光检测优势 谢谢 谢谢