优化蛋白质免疫印迹WesternBl

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1、符修乐20140127 Western Blot Western Blot定义p印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。p1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。p而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western BlotWestern Blot基

2、本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western BlotWestern Blot 一般流程一般流程p蛋白样品的制备pSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色 Western BlotWestern Blot（间接）（间接）一般流程:Western BlotWestern Blot可优化条件：可优化条件：l凝胶的配制和加样l2.转移膜的选择l3.封闭条件的选择l4.抗体浓度的确定l5.标记二抗的注意事项l6.洗涤条件的改善l7.检测方法的选择 W

3、estern Blotq不连续的电泳缓冲体系。qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳（泳（SDSSDSPAGEPAGE）Western Blot灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气加水液封加水液封 Western Blot灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子 Western Blot凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212（1）选择正确的凝胶浓度百分比）选择正确的凝胶浓度百分比 按将要检测的抗体对应的原始

4、抗原的分子量大小，计 算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。Western Blot（2）避免电泳中出现以下情况）避免电泳中出现以下情况条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好或电泳系统温 度偏高。条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适，特别是 凝胶和玻璃 挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾 样品溶解不好纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散 加样量过多 Western Blot需要注意：（1）凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓，放置加样孔出现不平。（2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲。（3）样品盐浓度过高会

5、挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度。（4）每个加样孔体积应一致，防止由于体积不同导致不同孔之间的挤压。（5）上样量太大及电压太高都会导致不正常条带的出现。Western Blot（3 3）要测定蛋白浓度，且加样量均匀，）要测定蛋白浓度，且加样量均匀，l收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。l目前常用比色法测定样品蛋白的含量，Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法（二喹啉甲

6、酸法）等。但各有优缺点，可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。l其中上样蛋白量不应超过30ug/mm2（载荷面即：如果胶槽是5mm1mm，则载荷面1mm5mm=5mm2)。Western Blot2.2.转转移膜的选择移膜的选择（1）最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。（2）膜的选择主要根据：膜的选择主要根据：a.膜与目的蛋白分子的结合

7、能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。Western Blot NC膜与膜与PVDF膜特性膜特性：p NC膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。pPVDF膜：与蛋白质亲和力高，物理强度，以及具有更好的化学兼容性，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其

8、更容易与带负电荷蛋白结合。Western Blot 三种膜的比较三种膜的比较 Western Blot3.3.封闭封闭p为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。（封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。）p常用的封闭试剂有 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。p封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。We

9、stern Blot4.4.抗体浓度的确定抗体浓度的确定p抗体和抗原之间的结合速率（亲和常数）是由它们在溶液中的相对浓度（还与其他变量之间，如温度和pH值）影响的，因此你通常需要调整抗体浓度，以获得更好的印迹。p如果抗体浓度过高，可能会导致条带位置不对或有非特性条带。p一抗与二抗使用不匹配的话，可能会没有条带或条带很浅。p所以应该对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度，才能获得最好的印迹。Western Blot如何滴定抗体浓度如何滴定抗体浓度p首先可根据产品推荐数据的稀释度范围，制定一个合适自己的一系列稀释度。比如产品建议浓度是1:1000，可以尝试1:250,1:500,1:2000,

10、1:4000等一系列浓度梯度。p如果缺乏参考稀释度，可以尝试将纯化的抗体按1g/mL为起始点。p需要注意的是，这些试验时都需要保持其他参数相同，包括：样本类型，孵育时间，洗涤时间和温度等。p其中二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。Western Blot5.二抗注意事项：二抗注意事项：p（1）注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者标志其他探针（如核素等）的。p（2）在酶连抗体中，使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。AP可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物

11、；而HRP可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。p二抗的HRP浓度过高，活性太强，会将底物消耗光，使胶片一片空白。p没有条带或很浅：HRP酶浓度太低，或者孵育时间不够。Western Blot6.洗涤洗涤p洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。对膜的洗涤被认为是不可缺少的。p如果背景很高：洗膜不充分，可以增加洗涤强度，增加膜洗涤次数和数量。p洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。Western Blot7.检测：显色方法的选择检测：显色方法的选择p化学显色法:方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测p化学发光法:灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测p同位素法:灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短p荧光底物法：同时检测一个以上的抗体 Western Blot小结l其应用：目的蛋白的表达特性分析，目的蛋白与其它蛋白的互作，目的蛋白的组织定位，目的蛋白的表达量分析。lWestern Blot实验条件的优化主要目的提高特定频带的信号-噪声比，减少非特异性条带等。l以上条件虽然不能优化所有，但是在一或两个变量上精心优化，还是会对实验结果的质量上有很大提高的。