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1、实验实验 0Y 果蝇遗传标志分析果蝇遗传标志分析-PAPD一、实验目的：一、实验目的：1.掌握掌握RAPD分析根本方法技术分析根本方法技术;2.了解分子标志的重要运用价值了解分子标志的重要运用价值.二、主要内容：二、主要内容：基因基因DNA提取提取 PCR反响反响 电泳电泳 电泳图谱的察看、分析电泳图谱的察看、分析 1D.Virilis-10只只 2黑腹果蝇黑腹果蝇P、F1、F2 3其他资料其他资料-0.2g1份份3种果蝇样品种果蝇样品+2种其他种其他/小组小组 果蝇用本人存的资料。果蝇用本人存的资料。资料：资料：1.提取粗提取粗DNA液液如今先做合理分工、协调时间：如今先做合理分工、协调时间
2、：每份资料普通果蝇每份资料普通果蝇20只、大果蝇只、大果蝇10只、或其他资料只、或其他资料0.2g+50L匀浆缓匀浆缓冲液匀浆冲液匀浆液体倒入液体倒入1.5ml离心管离心管+等等V苯酚苯酚-氯仿氯仿1:1颠倒混匀颠倒混匀30s,12000rpm，5分钟。分钟。助教把握时间！助教把握时间！+50 L 10%SDS颠倒混匀颠倒混匀20s，65度水浴度水浴30min参与参与200L的匀浆液的匀浆液10000rpm，3min，转移上清。转移上清。移上清于另一离心移上清于另一离心管，管，+等等V苯酚苯酚-氯氯仿仿1:1颠倒混颠倒混匀，匀，13000rpm，5分钟。分钟。12000rpm，10min移上清
3、于另一离心移上清于另一离心管，参与管，参与2倍体积倍体积的无水乙醇，静置的无水乙醇，静置10min。弃上清，弃上清，70%乙醇洗乙醇洗涤沉淀，涤沉淀，10000rpm，3min弃上清，超净台吹弃上清，超净台吹干沉淀。参与干沉淀。参与20ul的无菌水，溶解沉的无菌水，溶解沉淀，备用。淀，备用。留意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，留意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，枪头从液面上层往下层缓慢的挪动，不要带入其它杂质。枪头从液面上层往下层缓慢的挪动，不要带入其它杂质。1 组织匀浆液曾经预备好组织匀浆液曾经预备好：LiCl 0.40 molL-1 TrisHC
4、l 0.20 molL-1pH9.0 EDTA 2.5 mmolL-1RNaseA 100 gL-12 SDS 10%曾经预备好曾经预备好相关试剂相关试剂(3)25 x TAE(在在15离心时配制离心时配制)500ml 用于后边的电泳用于后边的电泳 Tris 12.1 g 冰醋酸冰醋酸 2.86 mL Na2EDTA2H2O 1.86 g ddH2O 定容到定容到100 mL (一人配置，全班公用，用时稀释一人配置，全班公用，用时稀释)三、实验原理三、实验原理:RAPD:建立在建立在PCR根底上的一种分子标志。根底上的一种分子标志。模板高温变性模板高温变性足够低的温度下通常为足够低的温度下通常
5、为36与随机与随机引物普通引物普通10个个bp退火退火 PCR 电泳电泳假设两个退火位点足够近假设两个退火位点足够近200-2000bp左右、分别位左右、分别位于互补的于互补的DNA链上，可以经过链上，可以经过PCR扩增出扩增出DNA片段。片段。引物结合位点引物结合位点DNA序列的改动以及两扩增位点之序列的改动以及两扩增位点之间间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差别，经电泳分别后经过目和长度的差别，经电泳分别后经过EB染色以检测染色以检测DNA片段的多态性。片段的多态性。假设位点假设位点2处碱基发生改动，那么处碱基发生改动，那么
6、3.RAPD反响反响1在在0.2ml PCR管中配制管中配制20l反响体系反响体系 随机引物随机引物 1L ddH2O 6L 每组领取每组领取5份样品所需量份样品所需量各组等分各组等分5份份 分别加分别加5种样品的模板种样品的模板DNA 各各 3L包括包括 dNTP Mixture,Taq酶酶,10PCR bufferPCR mixture 10 L 2在在PCR热循环仪中进展如下反响：热循环仪中进展如下反响：94 200s 94 60s36 60s72 120s 40个循环个循环72(300s-600s)4电泳后继课中电泳后继课中*1.5%琼脂糖凝胶用琼脂糖凝胶用20mL的的1TAE溶解琼脂
7、糖溶解琼脂糖配制电泳，察看比较不同品系或同一品系亲子代间的条配制电泳，察看比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。带的不同，并照相记录。*第第12周周“非中断杂交实验的非中断杂交实验的“扩菌、倒一切的平板步骤后可扩菌、倒一切的平板步骤后可以由一个同窗提早一会儿进展以由一个同窗提早一会儿进展操作分工操作分工技术问题技术问题本卷须知本卷须知实验课教师实验课教师助教指点：助教指点：实验报告为果蝇系列实验的最后部分：实验报告为果蝇系列实验的最后部分：1.简单表达简单表达RAPD的实验原理、处理的实验原理、处理的问题；的问题；2.实验结果照片显示出来信实验结果照片显示出来信号弱的可用画方
8、式图辅助表达，标出样品号弱的可用画方式图辅助表达，标出样品称号、差别条带等，进展分析。称号、差别条带等，进展分析。补充知识课后阅读：补充知识课后阅读：RAPDRFLPAFLPSTRSNPRFLP“AFLP续：续：由于变异、进化，一种引物可以使某一由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的品系的DNA片段复制扩增，而不能使另片段复制扩增，而不能使另一品系的一品系的DNA片段复制扩增。片段复制扩增。电泳分别：同一引物扩增电泳分别：同一引物扩增品系品系1品系品系2引物如：引物如：EcoRI和和MseI相关相关引物引物短串联反复序列短串联反复序列STRs (short tendem repeats,mi
9、ni-satellites)STR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%，根本单位是根本单位是1bp-8bp的串联反复，的串联反复，反复次数反复次数 n=15-60，知，知8000多个，多个，主要方式为：主要方式为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以，其中以(CA)n，(GT)n 为多为多见。见。1992年，年，Welssenbanch等以等以STR为标志的为标志的第二代连锁图取代了第二代连锁图取代了RFLP连锁图。连锁图。可变数目串联反复序列可变数目串联反复序列VNTRs(variable number tandem repeat
10、s)每个每个 VNTR 都含有都含有10-15 bp中心序列，中心序列，VNTR与与STR比较类似，但是反复顺序更长；比较类似，但是反复顺序更长；多态性及分布方面不如多态性及分布方面不如STR，因此，因此VNTR作作为遗传标志只是一种过渡，目前已较少运用，为遗传标志只是一种过渡，目前已较少运用，但是，但是，VNTR曾经对曾经对STR的基因定位运用起到的基因定位运用起到推进作用。推进作用。定义：不同个体间，基因组定义：不同个体间，基因组DNA某部位的某部位的 单核苷酸的变异。单核苷酸的变异。2019年，年，Lander报道了用单核苷酸多态性报道了用单核苷酸多态性标志标志single nucleo
11、tid polymorphism SNP制备第三代遗传连锁图的遗传标志。制备第三代遗传连锁图的遗传标志。可经过杂交、序列分析、电泳等检测。可经过杂交、序列分析、电泳等检测。单核苷酸多态性单核苷酸多态性single nucleotid polymorphism，SNP1，The most abundant DNA marker present in the human genome，about 90%of sequences variants in human are SNP.There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate th
12、at any two individuals differ by up to three million SNPs.2，A few hundred thousand are currently identified,but 17 million of SNPs out of 3 billion are estimated.3,SNPs in coding regions of genes have been termed cSNPs,about 500,000 of cSNPs and an average of about 6 per gene.Frequency of SNP in Hum
13、an Genome1,Neutral alteration:a base substitution with no effect on the amino acid residue encoded.2,Conservative change:a base substitution that results in an altered amino acid,but has minimal effect on protein structure or function.3,Non-conservative alteration:leading to a change in the encoded
14、amino acid residue that has dramatic effects on protein structure or function.The Functional Effects of cSNPs Major changes in protein structure can result from subtle variation in the genetic sequence encoding it.These changes can completely block the function of the protein in vivo and can also affect the development of high-throughput(高通亮高通亮)assays for screening therapeutic compounds.
0Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析ppt课件
