氯霉素分子印迹聚合物固相微萃取

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1、氯霉素分子印迹聚合物整体柱氯霉素分子印迹聚合物整体柱 的制备及其固相微萃取的制备及其固相微萃取 应用研究应用研究主要内容主要内容实验内容实验内容结果与讨论结果与讨论3研究背景研究背景12研究背景研究背景 氯霉素（氯霉素（CAPCAP）是一种广谱抗生素，因其具）是一种广谱抗生素，因其具有抗菌性强、药性稳定、价格低廉等优点而被广有抗菌性强、药性稳定、价格低廉等优点而被广泛用于畜牧和水产养殖业。但泛用于畜牧和水产养殖业。但CAPCAP又有抑制人体又有抑制人体骨髓造血功能而导致严重的毒副作用，故动物性骨髓造血功能而导致严重的毒副作用，故动物性食品和水产品中的食品和水产品中的CAPCAP残留对人类健康构

2、成极大残留对人类健康构成极大的威胁。欧盟和美国均在食品法规中规定的威胁。欧盟和美国均在食品法规中规定CAPCAP的的残留限量标准为残留限量标准为“零容许量零容许量”，随着食品安全越来，随着食品安全越来越受到世界各国及相关国际组织的日益关注，对越受到世界各国及相关国际组织的日益关注，对动物性食品中氯霉素的检测技术也提出了更高的动物性食品中氯霉素的检测技术也提出了更高的要求。要求。由于兽药残留分析属复杂基质中痕量组分的由于兽药残留分析属复杂基质中痕量组分的分析技术，待测物质浓度低，样品基质复杂，干分析技术，待测物质浓度低，样品基质复杂，干扰物质多扰物质多,所以需要对样品进行分离纯化和富集。所以需要

3、对样品进行分离纯化和富集。整体柱整体柱(monolith column)是是1989年首次提出年首次提出的，其制备简单、性能稳定，具有比表面积大、的，其制备简单、性能稳定，具有比表面积大、通透性好、传质速度快的优点。将整体柱应用于通透性好、传质速度快的优点。将整体柱应用于样品预处理，可以提高萃取容量和萃取效率，缩样品预处理，可以提高萃取容量和萃取效率，缩短萃取时间；也可应用于水溶液样品的提取，生短萃取时间；也可应用于水溶液样品的提取，生物兼容性好。分子印迹技术选择性高，去除基质物兼容性好。分子印迹技术选择性高，去除基质干扰效果好，是残留分析研究领域的一个新的发干扰效果好，是残留分析研究领域的一

4、个新的发展方向。展方向。鉴于分子印迹技术的高选择性和整体材料鉴于分子印迹技术的高选择性和整体材料的诸多优点，二者结合起来是一个必然的发展的诸多优点，二者结合起来是一个必然的发展趋势，即分子印迹聚合物整体柱技术。趋势，即分子印迹聚合物整体柱技术。本文以本文以CAP为模板分子，通过对分子印迹聚为模板分子，通过对分子印迹聚合物整体柱合成条件的优化，首次在小移液枪合物整体柱合成条件的优化，首次在小移液枪枪头里获得了对枪头里获得了对CAP有选择性提取的分子印迹聚有选择性提取的分子印迹聚合物整体微柱。并将该整体柱应用于食品中合物整体微柱。并将该整体柱应用于食品中CAP的分离富集，建立了的分离富集，建立了

5、牛奶中牛奶中CAP的分析方法，具的分析方法，具有选择性高、富集倍数和回收率高的优点。有选择性高、富集倍数和回收率高的优点。整体柱整体柱 所谓整体柱所谓整体柱,又称为棒状柱、连续床层、无塞柱，是一又称为棒状柱、连续床层、无塞柱，是一种用有机或无机聚合方法由单体种用有机或无机聚合方法由单体 、引发剂、引发剂 、致孔剂等混、致孔剂等混合物在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。这种色谱合物在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。这种色谱柱制备方法简单柱制备方法简单,由于使用了聚合方法可以往固定相中引入由于使用了聚合方法可以往固定相中引入各种可能的作用基团各种可能的作用基团 ，有十分多变的灵活性，同时用原

6、位，有十分多变的灵活性，同时用原位聚合制得的整体色谱柱要比常规装填的色谱柱具有更好的聚合制得的整体色谱柱要比常规装填的色谱柱具有更好的多孔性和渗透性，具有灌注色谱的特点，即色谱柱中既有多孔性和渗透性，具有灌注色谱的特点，即色谱柱中既有流动相的流通孔又有便于溶质进行传质的中孔（几十个纳流动相的流通孔又有便于溶质进行传质的中孔（几十个纳米）。因而可以对生物大分子进行快速分离米）。因而可以对生物大分子进行快速分离 ，而且色谱柱，而且色谱柱的稳定性很好。的稳定性很好。原位聚合法原位聚合法 原位聚合法原位聚合法(in situ polymerization)是一种将模是一种将模板分子、功能单体、交联剂、

7、引发剂、溶剂按照板分子、功能单体、交联剂、引发剂、溶剂按照一定比例混合，然后放在特定的容器一定比例混合，然后放在特定的容器(如液相色谱如液相色谱柱、毛细管柱等柱、毛细管柱等)中直接聚合。由于该法得到的聚中直接聚合。由于该法得到的聚合物，不需要研磨、过筛、沉降等繁琐的处理步合物，不需要研磨、过筛、沉降等繁琐的处理步骤可以直接用于分析，所以得到了很快的发展。骤可以直接用于分析，所以得到了很快的发展。原位聚合法还可以与一些其他的技术如膜、整体原位聚合法还可以与一些其他的技术如膜、整体柱等技术相结合，制备分子印迹膜柱等技术相结合，制备分子印迹膜(MIM)、分子印、分子印迹整体柱等。迹整体柱等。实验内容

8、实验内容 实验材料：实验材料：氯霉素氯霉素(CAP，99.4%)甲砜霉素甲砜霉素(TAP，99%)，甲硝唑，甲硝唑(MNZ)乙二醇二甲基丙烯酸酯乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，使用前用，使用前用NaOH溶液溶液萃取，再用超纯水洗后用无水萃取，再用超纯水洗后用无水MgS04干燥）干燥）偶氮二异丁腈偶氮二异丁腈(AIBN，使用前用无水乙醇重结晶，使用前用无水乙醇重结晶)4-乙烯基吡啶乙烯基吡啶(4-VP，95%)丙烯酰胺丙烯酰胺(AM)，甲基丙烯酸，甲基丙烯酸(MAA)，丙烯酸，丙烯酸(AA)分析纯甲苯、十二醇、色谱纯甲醇、乙腈等。分析纯甲苯、十二醇、色谱纯甲醇、乙腈等。Dionex ultim

9、ate 3000 HPLC仪仪(美国美国Dionex公司公司)兰格兰格LSP01-1A型注射泵型注射泵(保定兰格恒流泵有限公司保定兰格恒流泵有限公司)移液枪枪头移液枪枪头(4*49，200L)2.2 CAP-MIP 2.2 CAP-MIP整体柱的制备整体柱的制备氯霉素十二醇46L甲苯0.1 mmol 4-VP 1mmolEGDMA混匀超声4h混匀超声10min用100L进样针移取50L与用甲醇处理过的一端封口的移液枪枪头内，枪头用保鲜膜及硅胶封口于60 反应24h 除去保鲜膜及硅胶，剪开末端封口，用甲醇将模板分子洗净后备用。非印迹聚合物整体柱的制备：除不加模板分子外，其余步骤同上。2.3 CA

10、P-MIP2.3 CAP-MIP整体柱吸附性考察整体柱吸附性考察 1 mL 51 mL 5g gmL CAPmL CAP、TAPTAP和和MNZMNZ的混合水溶的混合水溶液，以液，以0.2 mL0.2 mLminmin过整体柱后，用过整体柱后，用100100L L甲醇洗甲醇洗脱，收集洗脱液直接进行脱，收集洗脱液直接进行HPLCHPLC分析，以考察选择分析，以考察选择吸附性。吸附性。分别将一定浓度的分别将一定浓度的CAP(10 CAP(10 g gmL)mL)、TAP(5 TAP(5 g gmL)mL)和和MNZ(5MNZ(5g gmL)mL)的水溶的水溶 液以液以0 005 mL05 mLmi

11、nmin过整体柱，直到流出液的峰面积与过整体柱，直到流出液的峰面积与上样水溶液的峰面积相等，记录每种物质总的上上样水溶液的峰面积相等，记录每种物质总的上样体积和流出液的相应浓度及体积，以考察吸附样体积和流出液的相应浓度及体积，以考察吸附容量。容量。2.4 条件优化条件优化分子印迹聚合物整体柱固相微萃取过程分子印迹聚合物整体柱固相微萃取过程 将将MIP整体柱与医用注射器组装起来，见图整体柱与医用注射器组装起来，见图 2-1(b)(c)，取，取4mL溶液，以溶液，以0.2 mL/min上样后，用上样后，用500此水以此水以0.2 mL/min清洗，再用清洗，再用100L甲醇以甲醇以0.1 mL/m

12、in洗脱，洗脱液直接进行洗脱，洗脱液直接进行HPLC分析。微萃取过分析。微萃取过程见程见 图图2-1(d)。合成合成MIP的条件优化的条件优化考察考察SPME-HPLC分析方法的色谱条件分析方法的色谱条件（a）（b）（c）（d）图图2-1 分子印迹聚合物整体柱固相微萃取装置及过程分子印迹聚合物整体柱固相微萃取装置及过程(a)分子印迹聚合物整体柱，分子印迹聚合物整体柱，(b)、(c)MIP整体柱与医用注射器的整体柱与医用注射器的组装，组装，(d)固相微萃取过程固相微萃取过程结果与讨论结果与讨论 本实验优化条件时均以富集因子本实验优化条件时均以富集因子(EF)(EF)和回收率和回收率(ER)(ER

13、)为评为评价标准。价标准。EFEF和和ERER定义如下：定义如下：EF=EF=ER=ER=100100=EF=EF100100其中其中:C:C0 0-上样水溶液的上样水溶液的CAPCAP浓度；浓度；V V0 0-上样水溶液的体积；上样水溶液的体积；C Ct t-过柱后的洗脱液过柱后的洗脱液CAPCAP浓度；浓度；V Vt t-过柱后的洗脱液体积；过柱后的洗脱液体积；印迹因子印迹因子(IF)(IF)定义定义IF=IF=其中：其中：EFEFMIPMIP-CAP-CAP在在CAP-MIPCAP-MIP整体柱上的富集因子整体柱上的富集因子 EF EFNMIPNMIP-CAP-CAP在在NMIPNMIP

14、整体柱上的富集因子整体柱上的富集因子C Ct tC C0 0C Ct tC C0 0V V0 0V Vt tV V0 0V Vt tEFEFMIPMIPEFEFNMIPNMIP选择性因子（选择性因子（f）定义为：）定义为：f1=f2=其中其中:QCAP-CAP在在CAP-MIP整体柱上的饱和吸附量整体柱上的饱和吸附量 QTAP-TAP在在CAP-MIP整体柱上的饱和吸附量整体柱上的饱和吸附量 QMNZ-MNZ在在CAP-MIP整体柱上的饱和吸附量整体柱上的饱和吸附量QCAPQTAPQCAPQMNZ合成条件的优化合成条件的优化功能单体种类的选择图3-1 功能单体种类的影响3.1.2 交联剂用量的

15、影响图3-2 交联剂用量影响 从图可看出当CAP：EGDMA=1:20，即EGDMA为l mmol时CAP-MIP整体柱的选择性和富集效果最佳。3.1.3 功能单体用量的影响图3-3 功能单体用量的影响 从图中可看到当CAP与4-VP的比例分别为1:2及1:4时，CAP-MIP整体柱对CAP均有较好的富集效果，但当二有的比例为1:2时CAP-MIP整体柱对CAP的分离选择性更好。图3-4 CAP-MIP整体柱分子识别位点的作用原理 因因CAP与分子印迹整体柱中的三维空穴在分子大小和与分子印迹整体柱中的三维空穴在分子大小和形状上完全匹配，其上的羟基氢原子能与形状上完全匹配，其上的羟基氢原子能与4

16、-VP上的氮原子上的氮原子相作用形成氢键而被识别保留在柱内。由于相作用形成氢键而被识别保留在柱内。由于CAP上有两个上有两个羟基氢原子，羟基氢原子，4-VP分子上仅有一个氮原子，即一个分子分子上仅有一个氮原子，即一个分子CAP恰好能与两分子的恰好能与两分子的4-VP相作用，与实验结论相符相作用，与实验结论相符。3.1.4 溶剂种类的影响表3-1溶剂种类及用量 表3-2溶剂的介电常数及极性图3-5 溶剂种类的影响 3.2 CAP-MIP3.2 CAP-MIP整体柱吸附性考察整体柱吸附性考察3.2.1 CAP-MIP3.2.1 CAP-MIP整体柱结构表征整体柱结构表征图3-6 CAP-MIP整体

17、柱扫描电镜图 从图中可以看到从图中可以看到CAP-MIP整体柱上有许多大孔，有利于增加整体柱上有许多大孔，有利于增加萃取容量和加速待分析物在柱内部的传质。萃取容量和加速待分析物在柱内部的传质。3.2.2 吸附选择性考察吸附选择性考察图3-7 CAP(A)、TAP(B)和MNZ(C)在NMIP和MIP整体柱上的吸附性能比较 1、2、3分别为5 g/mL CAP、TAP和MNZ混合溶液直接进样、经NMIP萃取后进样和MIP-SPME后进样的色谱图 萃取条件的优化萃取条件的优化3.3.1 上样流速的考察 将6 mL 0.2 g/mL CAP水溶液分别以 、0.4 mL/min的流速过 CAP-MIP

18、整体柱，用500 L水以0.2 mL/min清洗，再用100 L甲醇洗脱后直接进行HPLC分析。结果发现富集因子（EF）与回收率（ER）无明显的变化，即上样流速对萃取影响不大，考虑到实验速度，后续实验选择0.2 mL/min。清洗液种类及体积的影响图3-8 水中添加不同比例的甲醇做清洗液时对富集因子(A)和回收率(B)的影响 从图中可看到，随着水中甲醇含量的增加，从图中可看到，随着水中甲醇含量的增加，EF和和ER均逐渐减小，均逐渐减小，故选择纯水为清洗液。故选择纯水为清洗液。本实验还考察了清洗液体积分别为本实验还考察了清洗液体积分别为500 L和和l mL时对萃取效果时对萃取效果的影响，结果发

19、现的影响，结果发现EF和和ER均无明显变化，为了尽量的缩短萃取时间，均无明显变化，为了尽量的缩短萃取时间，选择清洗液的体积为选择清洗液的体积为500 L。EFEF洗脱液种类的影响图3-9 甲醇中添加不同比例的水作洗脱液时对富集因子(A)和回收率(B)的影响 图3-10 不同比例的甲醇与乙酸作洗脱液时富集因子(A)和回收率(B)的影响 从图3-9可以看出随着洗脱液中水比例的增加，EF和ER均降低。从图3-10 可以看出酸度对萃取效果的影响较小。因此，选择纯甲醇为最佳的洗脱液。3.3.4 洗脱液流速的影响图3-11 洗脱液流速对富集因子(A)和回收率(B)的影响 3.3.5 上样体积的影响图3-1

20、2 上样体积对富集因子(A)和回收率(B)的影响 从图中可以看出增大上样体积可以提高富集因从图中可以看出增大上样体积可以提高富集因子，但回收率却有所降低。综合考虑子，但回收率却有所降低。综合考虑EF、ER及萃取及萃取时间，选择时间，选择4 mL为最佳上样体积。为最佳上样体积。3.3.6 溶液酸度的影响图3-13溶液的酸度改变对富集因子(A)和回收率(B)的影响 CAP在弱酸或中性溶液中较稳定，遇碱易分解，故本实验只在弱酸或中性溶液中较稳定，遇碱易分解，故本实验只考虑酸性和中性条件下的影响。由图可见，提高溶液的酸度后，考虑酸性和中性条件下的影响。由图可见，提高溶液的酸度后，萃取效果变差，因此选择

21、不改变样品溶液的萃取效果变差，因此选择不改变样品溶液的pH值。值。3.3.7 离子强度的影响图3-14样品溶液的离子强度对富集因子(A)和回收率(B)的影响 在上述优化的萃取条件下，向溶液中加入不同量的 NaCI 固体(0-30(wv)进行实验，考察样品溶液离子强度对MIPM-SPME效率的影响，由图可见，离子强度的改变对EF影响不大，但ER有些许增大。考虑到加盐后会使MIP整体柱的压力增大，缩短整体柱寿命，而且在不加盐时也有很好的回收率，故选择不改变溶液的离子强度。3.4 方法的评价图3-15 空白牛奶样品添加CAP(1g/g)直接HPLC分析(1)和 CAP-MIPM-SPME-HPLC分

22、析(2)色谱图 上图是牛奶样品添加1 g/g直接HPLC分析与经过CAP-MIPM-SPME后进行HPLC分析的色谱图。显然，通过CAPMIP整体柱提取富集后牛奶中的基质干扰大大降低，且CAP的色谱峰明显升高，即该分析方法对CAP具有很好的选择性提取和富集效果，可以有效去除基质干扰，提高HPLC分析的灵敏度和选择性。小结小结(1)(1)以以CAPCAP为模板分子，采用原位聚合法制备了分子印迹聚合物为模板分子，采用原位聚合法制备了分子印迹聚合物整体柱。通过对合成条件的优化，得到最佳的条件为：整体柱。通过对合成条件的优化，得到最佳的条件为：CAP:4-VP:EGDMA=1:2:20CAP:4-VP

23、:EGDMA=1:2:20，甲苯和十二醇为溶剂。，甲苯和十二醇为溶剂。(2)(2)在最佳条件下得到的分子印迹聚合物整体柱对在最佳条件下得到的分子印迹聚合物整体柱对CAPCAP的印迹因的印迹因子为，对子为，对CAPCAP、TAPTAP、MNZMNZ的饱和吸附量分别为、和的饱和吸附量分别为、和 g g。选。选择性因子择性因子f f1 1，f f2 2=。(3)(3)将其应用于固相微萃取，最佳的将其应用于固相微萃取，最佳的MIPM-SPMEMIPM-SPME条件为：上样条件为：上样4mL4mL，上样流速，上样流速0.2 mL/min;500 0.2 mL/min;500 L L水作清洗液，流速为水作清洗液，流速为 0.2 mL/min0.2 mL/min；100 100 L L甲醇作洗脱液，流速为。在此条件下测甲醇作洗脱液，流速为。在此条件下测定牛奶中定牛奶中CAPCAP残留，得到残留，得到CAPCAP在在0.052000.05200 g/gg/g的浓度范围内的浓度范围内线性关系良好，检测限线性关系良好，检测限(LOD)(LOD)为为17 ng17 ngg g，平均加标回收率，平均加标回收率为。为。Thank you!