氨基酸纸层析、糖旋光度的测定a

《氨基酸纸层析、糖旋光度的测定a》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氨基酸纸层析、糖旋光度的测定a（25页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、实验五实验五氨基酸的纸层析氨基酸的纸层析糖旋光度的测定糖旋光度的测定1.学习层析（色谱）分离技术。学习层析（色谱）分离技术。2.学习旋光度测定技术。学习旋光度测定技术。实验目的：实验目的：一、氨基酸的纸色谱一、氨基酸的纸色谱 色谱法：色谱法：根据不同根据不同溶质溶质在在固定相固定相和和流动相流动相之间的作用力之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，在随着流动相经过固（分配、吸附、离子交换等）的差别，在随着流动相经过固定相时，在两相之间形成多次平衡，被流动相带动移动的速定相时，在两相之间形成多次平衡，被流动相带动移动的速度不同，达到分离效果的方法。度不同，达到分离效果的方法。固定相固定相：

2、固定不动，对样品产生保留作用的物质。：固定不动，对样品产生保留作用的物质。流动相流动相：带动样品，经过固定相的物质。：带动样品，经过固定相的物质。色谱过程的实质：是样品在固定相中吸附与解析的过程。色谱过程的实质：是样品在固定相中吸附与解析的过程。按按分离机制分离机制，可分为：，可分为：吸附色谱：吸附色谱：分子在两相中吸附性能不同，进行分离分子在两相中吸附性能不同，进行分离分配色谱：分配色谱：分子在两相中分配系数不同，进行分离分子在两相中分配系数不同，进行分离离子交换色谱：离子交换色谱：分子在两相中离子交换性能不同，进行分离分子在两相中离子交换性能不同，进行分离体积排阻色谱：体积排阻色谱：体积大

3、的留在固定相的小孔内，体积小的先体积大的留在固定相的小孔内，体积小的先 流出。流出。亲和色谱：亲和色谱：分子在两相中亲和力不同，进行分离。分子在两相中亲和力不同，进行分离。电泳色谱、电色谱：电泳色谱、电色谱：离子在电场中移动的速度不同进行分离离子在电场中移动的速度不同进行分离色谱法分类色谱法分类按按操作方式操作方式不同，又可分为：不同，又可分为：柱色谱柱色谱气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱薄层色谱薄层色谱纸色谱纸色谱等等固定相固定相组分组分纸色谱：纸色谱：为为分配色谱分配色谱，滤纸为载体，固定相为滤纸上的水分，滤纸为载体，固定相为滤纸上的水分，流动相（展开剂）为用水饱和过的有机溶剂。流

4、动相（展开剂）为用水饱和过的有机溶剂。操作技术：上行法、下行法、环行法操作技术：上行法、下行法、环行法纸色谱、薄层色谱的一般操作步骤纸色谱、薄层色谱的一般操作步骤1.制板（纸）制板（纸）将一个将一个1.5cm 长、长、1cm 宽的滤纸，剪成扇子状，并卷宽的滤纸，剪成扇子状，并卷起来起来滤纸芯儿的制作滤纸芯儿的制作在滤纸中央，用铅笔画一个半径的圆圈（直径一角硬币大在滤纸中央，用铅笔画一个半径的圆圈（直径一角硬币大小）。小）。在圆圈中心扎一个孔，插入准备好的滤纸芯儿。在圆圈中心扎一个孔，插入准备好的滤纸芯儿。插入时，滤纸芯的扇花部分插进滤纸孔一小部分，以盖到培插入时，滤纸芯的扇花部分插进滤纸孔一小

5、部分，以盖到培养皿上方时不碰到液体为准。养皿上方时不碰到液体为准。2.点样点样毛细管点样：毛细管与板（纸）垂直，毛细管点样：毛细管与板（纸）垂直，点样位置、点样距离：不被展开剂浸泡、以显色后点之间易分开为准。点样位置、点样距离：不被展开剂浸泡、以显色后点之间易分开为准。点样量、样品浓度：轻轻点一次即可。点样量、样品浓度：轻轻点一次即可。本次实验：点三个样品本次实验：点三个样品两个标准样品，一个混合样品两个标准样品，一个混合样品3.展开展开将薄层板斜放入层析缸中（或将滤纸挂在层析缸中），层析缸中流将薄层板斜放入层析缸中（或将滤纸挂在层析缸中），层析缸中流动相（展开剂）的量以不浸泡样点为宜。有些层

6、析缸如下图，易进动相（展开剂）的量以不浸泡样点为宜。有些层析缸如下图，易进行先饱和后展开操作，提高重现性和避免边缘现象。行先饱和后展开操作，提高重现性和避免边缘现象。边缘现象：两边高边缘现象：两边高本次纸色谱实验展开步骤：本次纸色谱实验展开步骤：1.在培养皿中加入适量展开剂在培养皿中加入适量展开剂2.把点好样的滤纸放到培养皿上，注意滤纸芯儿不能碰展开剂。盖上培把点好样的滤纸放到培养皿上，注意滤纸芯儿不能碰展开剂。盖上培养皿养皿饱和饱和510分钟。分钟。3.把滤纸芯儿压下去，使滤纸芯儿的另一端稍微扇开，并接触展开剂，把滤纸芯儿压下去，使滤纸芯儿的另一端稍微扇开，并接触展开剂，开始展开。开始展开。

7、4.当流动相（展开剂）的前沿到达滤纸边当流动相（展开剂）的前沿到达滤纸边1cm左右时，停止展开，立即取左右时，停止展开，立即取出滤纸，用铅笔画出展开剂前沿线。出滤纸，用铅笔画出展开剂前沿线。5.去溶剂：烘干去溶剂：烘干展开剂前沿线展开剂前沿线饱和饱和展开展开画出展开剂前沿画出展开剂前沿4.显色显色可见光下观察可见光下观察紫外灯下观察紫外灯下观察显色剂显色：显色剂显色：通用：通用：10%硫酸乙醇溶液；碘蒸气；硫酸乙醇溶液；碘蒸气；大部分有机样品：磷钼酸大部分有机样品：磷钼酸/乙醇溶液乙醇溶液专用：专用：碘化铋钾碘化铋钾 生物碱；生物碱；三氯化铁三氯化铁 黄酮；黄酮；茚三酮茚三酮 氨基酸氨基酸 显

8、色操作：将茚三酮喷至滤纸润湿，不易流淌显色操作：将茚三酮喷至滤纸润湿，不易流淌5.计算比移值计算比移值Rf f 值的意义：值的意义：定性分析的指标定性分析的指标评价展开剂选择是否合适、评价分离效果评价展开剂选择是否合适、评价分离效果 薄层层析：薄层层析：Rf f ，Rf 纸纸 层层 析：析：Rf f，Rf 2、影响旋光度的因素、影响旋光度的因素测定波长、浓度、测定管长度、溶剂、温度测定波长、浓度、测定管长度、溶剂、温度比旋光度比旋光度：旋光管长度，：旋光管长度，dm 1）按通电源，预热约）按通电源，预热约5min2）零点误差校正）零点误差校正选定并选定并清洗清洗测定管：用水洗（留意密封垫和玻璃

9、透光片，测定管：用水洗（留意密封垫和玻璃透光片，不要宁得太紧，否则读数不准）不要宁得太紧，否则读数不准）装入水：排气泡，旋上螺盖（不易过紧）装入水：排气泡，旋上螺盖（不易过紧）放入样品管槽：玻璃泡部位在上部放入样品管槽：玻璃泡部位在上部调零点视野确定零点误差：数值与误差方向调零点视野确定零点误差：数值与误差方向检查旋光仪零位是否准确，即在旋光仪未放试管或放进检查旋光仪零位是否准确，即在旋光仪未放试管或放进充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。如不一致，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加如不一致，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加

10、上该偏差值。上该偏差值。4、旋光仪的使用和旋光度的测定方法、旋光仪的使用和旋光度的测定方法测定旋光读数：测定旋光读数：转动度盘、检偏镜、在视场中觅得亮度一转动度盘、检偏镜、在视场中觅得亮度一致且致且暗暗的位置，再从度盘上读数。读数是正（顺时针方向旋的位置，再从度盘上读数。读数是正（顺时针方向旋转）的为右旋物质，读数是负（逆时针方向旋转）的为左旋转）的为右旋物质，读数是负（逆时针方向旋转）的为左旋物质。物质。读数方法：读数方法：主尺分主尺分180格，每格格，每格1；游标尺分；游标尺分10格，每大格格，每大格0.1，每小格，每小格0.05 。1.先看游标尺先看游标尺0刻度线指向主尺的哪两个数之间：

11、图中刻度线指向主尺的哪两个数之间：图中9和和10 之间之间 则旋光度为则旋光度为2.看游标尺刻度线与主尺刻度线重合的位置：图中游标尺的看游标尺刻度线与主尺刻度线重合的位置：图中游标尺的3 则代表则代表因此该物质旋光度为因此该物质旋光度为 右旋右旋9.30 1主尺逆时针旋转：左旋主尺逆时针旋转：左旋0刻度线，也是180度线刻度：刻度：右旋右旋右旋右旋左旋左旋左旋左旋+30，-150 可以说刻度是右旋可以说刻度是右旋30度，或左旋度，或左旋150度度实际旋光度是多少，再稀释一半物质后测定，是实际旋光度是多少，再稀释一半物质后测定，是15度，表明就是右旋的度，表明就是右旋的（3）已知浓度的葡萄糖的测

12、定：）已知浓度的葡萄糖的测定：试样管润洗、装入试样管润洗、装入10%葡萄糖溶液（葡萄糖溶液（0.1g/ml)，调零点视场并读数。，调零点视场并读数。（4）稀释葡萄糖的测定，确定旋光方向：）稀释葡萄糖的测定，确定旋光方向：取出样品管，加入葡萄糖的稀释溶液，调零点视场并读数。取出样品管，加入葡萄糖的稀释溶液，调零点视场并读数。（5）未知浓度的葡萄糖的测定：）未知浓度的葡萄糖的测定：取出样品管，加入不知浓度的葡萄糖溶液，调零点视场并读数。取出样品管，加入不知浓度的葡萄糖溶液，调零点视场并读数。（6）结果处理：）结果处理：扣除零点误差：同方向减，异方向加。扣除零点误差：同方向减，异方向加。由已知样算出比旋光度，再结合未知样的旋光度，算出未知样的浓度。由已知样算出比旋光度，再结合未知样的旋光度，算出未知样的浓度。左盘刻度左盘刻度右盘刻度右盘刻度平均旋光平均旋光度值度值（+）（-）校正后值校正后值（+）（-）管管长长温温度度（+）（-）（+）（-）校正校正1校正校正2校正校正3已知已知样品样品稀释稀释样品样品未知样未知样品品未知未知样样浓浓度度糖旋光度的测定数据记录表糖旋光度的测定数据记录表