荧光染料基础知识大全

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1、荧光染料基础知识大全益阳纺织染整团队今天荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白GFP。在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。1免疫荧光(IF)在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋

2、白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。最简单的方式是

3、使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。这种方法被称为“直接免疫荧光法”。在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记（一抗）。第二种抗体本身就携带荧光染料（二抗），并且可以特异性结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”。这种方法存在诸多优势。一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括 FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor染料，下文均有提及。2FITC 和 TRITC异硫氰酸荧光素(FITC)

4、 是一种有机荧光染料，目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。在 495/517 nm 处，该染料会产生激发/发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。而它的基本成分 荧光素，其摩尔质量为 332 g/mol，常被用作荧光示踪剂。FITC(389 g/mol) 是用于荧光显微镜技术的首批染料，且其被当成Alexa Fluor488 等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统，而该系统受蓝色光谱中的光所激发。经常与 FITC 同时使用的另一种染料是与其相似的TRITC 四甲基罗丹明-5(6

5、)-异硫氰酸。与 FITC 相反，TRITC 并非荧光素，而是罗丹明家族的衍生物。罗丹明也具有一个大的共轭芳香电子系统，正是该系统引发了它们的荧光行为。还有一点与FITC 相反，TRITC (479 g/mol) 由最大波长为 550nm的绿色光谱中的光所激发，它的最大发射波长为 573 nm。与蛋白质（例如，抗体）结合也基于异硫氰酸盐反应基团。虽然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它们属于发光相对较弱的荧光染料且它们的优势仅仅是经济实惠，因此，在最新的显微镜技术中并不推荐。图 1：果蝇胚胎发育，绿色：FITC；红色：TRITC3青色素这类荧光染料相对较少，从青色素衍生而来，也是其名

6、称的由来：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通过其反应基团与核酸或蛋白相连。例如，采用了蛋白标记的马来酰亚胺基团。有趣的是，对于荧光，Cy5 对其周边电子环境非常敏感，该特征可用于酶测定。附着蛋白质的构象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。此外，Cy3 和 Cy5 还可用于 FRET 试验。青色素染料是一种相对较老的荧光染料，但却是其他荧光染料在亮度、耐光性、量子产率等方面得以改善的基础。4Alexa Fluor染料Alexa Fluor染料是带负电荷且亲水的荧光染料系列，该系列染料囊括范围较广，且经常用于荧光显微镜技术之中。这些染料的名称是由其发明者Richard Pa

7、ul Haugland 以他儿子 Alex Haugland 的名字命名的。该产品标识是 Molecular Probes（美国生命科学技术公司 Life Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收购）的商标。此外，这些产品标识中也涵盖了相应的激光激发波长。例如，应用范围很广且最大激发波长为 493 nm的Alexa Fluor488，可由标准的488 nm激光激发。Alexa Fluor488的最大发射波长为 519 nm，正是因为具备上述特性，使得 Alexa Fluor488与 FITC 的属性相似。尽管 Ale

8、xa Fluor488是一种荧光素衍生物，但与 FITC 相反，它拥有更佳的稳定性和荧光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor 染料（比如，Alexa Fluor546、Alexa Fluor633）都是不同基础荧光物质的磺化形式，例如，荧光素、香豆素、青色素或罗丹明，它们的摩尔质量在410 至 1400 g/mol 范围之内。图 2：小鼠转基因胚胎、肢间体节，E10.5 小鼠转基因胚胎的 5 个肢间体节：EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488 免疫组化染色；用 Desmin-Cy3 对胚胎肌肉纤维进行染色，用 Hoechst Size 自上而下揭示细

9、胞核：3.5 mm (a)，800m (b)。图片来源：Aurlie Jory, CellulesSouches et Dveloppement, Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre of IGBMC, IGBMC。图 3：小鼠成纤维细胞，绿色：F-Actin，FITC；红色：Tubulin，Cy5；蓝色：细胞核，DAPI。图片来源：德国海德尔堡马克斯-普朗克研究所Gnter Giese博士5DNA 染色在荧光显微镜技术中，不只研究蛋白结构，核酸同样具有重要的研究意义。有时候，必须通过检测细胞核来确定细胞的精确位置及其数量。最常用

10、的一种DNA 染色剂当属 DAPI (4,6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可与DNA 双螺旋的 A-T 富集区域相结合。如果 DAPI 附着到 DNA 上，其荧光强度将比游离状态要高。该染色剂受最大波长为358 nm的紫外光激发，其发射光谱非常宽，在461 nm 处达到峰值。此外，还可对弱荧光进行 RNA 结合检测。在这种情况下，发射波长将转移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能够穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞之中。第二种被广泛使用的DNA 染色剂就是 Hoechst 染料系列，这些染料原先都是由 Hoechst AG 这家化学公司生产的。Hoechst 33258、Hoec

11、hst 33342以及Hoechst 34580 均为双苯酰亚胺，可嵌入 A-T 富集区域，因此，该系列染料很少用到。与 DAPI 相似，这三种染色剂都可受最大发射波长为455 nm的紫外光激发，而未被结合的染色剂，其最大发射波长在 510540 nm 之间。Hoechst 染色剂还具有细胞渗透性，因此可用于活细胞或已固定的细胞中。该染色剂与DAPI 的不同之处在于，它们的毒性较低。碘化丙啶（Propidium-Iodide，PI）是一种不能透过细胞膜的 DNA 染色剂。由于具备上述特性，该染色剂无法进入完整的细胞中，因此，该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶还是一种嵌入

12、剂，但对于不同的碱基并不存在结合的差异性。该染色剂与核酸结合后，最大激发波长为538 nm，最大发射波长为 617 nm。未结合 PI 的最大激发和发射波长和光强会更低一些。PI 还可结合 RNA，同时无需改变自身的荧光特性。有时候为了区分DNA 和 RNA，有必要使用适当的核酸酶。不需要前期处理，吖啶橙就可以鉴别DNA 与 RNA 。吖啶橙与 DNA 结合后，最大激发/发射波长为 502 nm/525 nm，而与 RNA 结合后，最大激发/发射波长为460 nm/650 nm。此外，它还能够进入溶酶体等酸性区室。在这里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境下，吖啶橙由蓝色光谱中的光激发，但发射

13、波长在橙色区域达到最大。由于凋亡细胞具有大量被吞噬的酸性区室，因此，吖啶橙常用作此类细胞的标记物。6区室和细胞器特异性染料在荧光显微镜技术中，往往要对溶酶体、核内体等细胞区室以及线粒体等细胞器进行染色。为此，该部分介绍了一系列可供选择使用的特异性染料。观察线粒体最常用的方法就是利用 MitoTracker，它是一种可透过细胞的染料，包含轻度巯基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可与半胱氨酸残基的游离硫醇基反应，从而与基质蛋白实现共价结合。MitoTracker 有不同的颜色和修饰类型（参见表 1），此外，它还是 Molecular Probes 的商标。与罗丹明 123 (Rh123) 或 te

14、tramethylrosamine等常规线粒体特异性染色剂不同，在用固定剂破坏膜电位后，MitoTracker不会被洗掉。依据线粒体染色剂，还有些染料可以标记溶酶体等酸性区室，这类染料被称为LysoTracker。它们由连接一个荧光基团的弱碱基团组成，具有膜穿透性。最有可能的情况是，这些碱基因质子化作用的影响而对酸性区室具有亲和性。LysoTracker具有多种不同的颜色可供选择（参见表 1）。与溶酶体相似的区室是酿酒酵母等真菌中的液泡，这种膜密闭空间也是一种酸性环境。如果要在荧光显微镜下观察上述区室，则要使用FM 4-64或FM 5-95等苯乙烯基染料。对于蛋白质分泌实验，内质网 (ER)

15、具有重要的研究意义。对上述区室进行染色的一种典型染料为DiOC6(3)。该染料虽然偏好 ER，但仍会结合线粒体等其他细胞器膜。对ER 进行特异性染色的另一种方法是，使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker，而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的两种染料，其与格列本脲（一种磺酰基脲酶）连接，并可与仅存于内质网膜上的ATP敏感性钾通道结合。BODIPY（硼-二吡咯亚甲基，boron-dipyrromethene）是一种几乎不溶于水的、对pH 相对不敏感的染料基团，该染料对蛋白质标记没太大用处，但却是脂质和膜标记的良好工具。对于

16、与ER相邻的高尔基体，可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等荧光神经酰胺类似物对其进行标记。 上述神经酰胺为鞘脂类，其在高尔基体中高度富集。借助基于脂质的染料，可以对脂筏等特异膜区域进行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以观察胆固醇富集区域（Avanti Polar Lipids）。除了使用特异性非蛋白荧光染料对细胞区室进行标记之外，还可以借助对细胞中不同位置有偏好的蛋白质对目标区域进行染色。这些蛋白质可以和荧光染料相连，并可通过荧光显微镜进行观察。运用这种方法的一个实例是：麦胚凝集素(WGA)

17、可以与细胞质膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特异性结合，将WGA 与荧光染料偶联，这样我们就可以观察到细胞质膜了。图 4：Pukinje细胞，小鼠小脑皮质三重标记的纵侧截面图。红色：anticalbindinD28k/Cy3；绿色：anti-GFAP/Cy5；蓝色：Hoechst 33258图 5：牛肺部内皮细胞。红色：用 MitoTrackerRed CMXRos 标记的线粒体；绿色：用绿色荧光 BODIPYFLphallacidin 标记的纤维状肌动蛋白；蓝色：用 DAPI 标记的细胞核。使用三维盲反褶积可以改善该图像的质量。7离子成像在有关神经元方面的研究中，观察基因活性或细胞运动等对于

18、了解细胞的离子浓度具有重要意义。钠、钙、氯或镁离子对很多不同的细胞活动都具有较大影响。一般情况下，借助荧光标记的螯合剂可将离子困住，螯合剂在结合相应离子后会改变离子的光谱特性。例如，利用该原理的钙指示剂fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green 等。对于钠离子的检测，通常使用 SBFI (sodium-bindingbenzofurzanisophthalate) 或Sodium Green。PBFI(potassium-binding benzofurzanisophthalate) 可以检测钾离子。有趣的是，还存在以蛋白质为主的钙指示剂，其中一种是基

19、于水母化学发光蛋白水母素。水母素、发光体腔肠素、分子氧和 Ca2+的相互作用会释放蓝光，这是在荧光蛋白质的发现过程中非常著名的机制。8生产实践原来高品质的荧光单子也是那么容易搞定的我们先来看下这组荧光料分散荧光染料在纺织领域的应用局限于涤纶錦纶等合成纤维及其混纺织物的染色。分散荧光染料的品类也相对越来越丰富，一般有荧光黄系列，例如：荧光黄10GN,荧光黄8GFF。荧光红系列，例如：荧光桃红BG，荧光桃红FBS，分散荧光红G等等。在荧光蓝的领域相对还是有点空缺的。下面以荧光红G（DISPERSE RED G .CAS:70294-19-8）为例跟大家探讨染色过程中所需要注意的几个问题。1，PH值

20、对分散荧光红G上染情况的影响。在pH值偏碱时，布样的ks值很低，G红上色很浅且发兰不够鲜艳。ph值偏酸时，布样的ks值也不是最大，色光偏兰，同样不够鲜艳。pH值在5.5-6.5左右时，上色最好.所以分散荧光红G上色的pH与一般分散染料有所不同，它对PH的要求更高，染液偏碱或偏酸都会影响其上色效果。2，水质对G红上色的影响。众所周知，织布染色的匀染性和通透性与水质息息相关，螯合分散剂的应用中越来越重要。通过实践，螯合分散剂的加入对布样ks值的影响不是很大。说明对颜色的深浅没有太大的影响。通过布样色光的对比，螯合分散剂的添加使得布样的颜色更加鲜艳，不加螯合分散剂的布样明显发兰，发旧，不能充分发挥分

21、散荧光红G的荧光效果。3，染色温度的影响升温曲线到100度时，布样的ks明显增加，得色率随着温度的升高而增大，在135度时ks值最高，数值上130度和135度时，布样的ks值接近，在生产过程中，考虑到成本和其它因素影响，选择13O度上染。这个跟常规分散染料的数据基本吻合。4，保温时间的影响布样的KS值随着保温的时间增加而变大，保温60分时，KS值最大。保温90分时，ks值变小。这是因为染料上染织物是吸附和解吸的过程。保温时间过长，解吸到染夜中的染料越多，ks值越小。说明分散荧光红G保温60分钟时，得色率最高，染色最饱和。9荧光染料及其激发和发射波长峰值上文提到的所有染料在下表中均有统计。此外，

22、还涵盖了其他荧光染料及其激发和发射波长峰值。荧光染料示例激发光Indo-1, Ca saturated331 nmIndo-1 Ca2+346 nmCascade Blue BSA pH 7.0Cascade Blue398 nmLysoTracker Blue373 nmAlexa 405LysoSensor Blue pH 5.0374 nmLysoSensor Blue374 nmDyLight 405399 nmDyLight 350332 nmBFP (Blue Fluorescent Protein)380 nmAlexa 350343 nm7-Amino-4-methylcoum

23、arin pH 7.0346 nmAmino Coumarin345 nmAMCA conjugate347 nmCoumarin360 nm7-Hydroxy-4-methylcoumarin360 nm7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0361 nm6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0358 nmHoechst 33342352 nmPacific BlueHoechst 33258352 nmHoechst 33258-DNA352 nmPacific Blue antibody conjugate p

24、H 8.0PO-PRO-1PO-PRO-1-DNAPOPO-1POPO-1-DNADAPI-DNA359 nmDAPI358 nmMarina Blue362 nmSYTOX Blue-DNACFP (Cyan Fluorescent Protein)eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein)1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS)375 nmIndo-1, Ca free346 nm1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)375 nmBO-PRO-1-

25、DNABOPRO-1BOBO-1-DNASYTO 45-DNAevoglow-Pp1evoglow-Bs1evoglow-Bs2Auramine ODiOLysoSensor Green pH 5.0Cy 2489 nmLysoSensor GreenFura-2, high Ca336 nmFura-2 Ca2+sup336 nmSYTO 13-DNAYO-PRO-1-DNAYOYO-1-DNAeGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)LysoTracker Green503 nmGFP (S65T)BODIPY FL, MeOH502 nmSapph

26、ire396 nmBODIPY FL conjugate503 nmMitoTracker GreenMitoTracker Green FM, MeOHFluorescein 0.1 M NaOHCalcein pH 9.0Fluorescein pH 9.0CalceinFura-2, no Ca367 nmFluo-4FDADTAFFluoresceinFluorescein antibody conjugate pH 8.0CFDAFITCAlexa Fluor 488 hydrazide-waterDyLight 4885-FAM pH 9.0FITC antibody conjug

27、ate pH 8.0Alexa 488Rhodamine 110Rhodamine 110 pH 7.0Acridine OrangeAlexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0BCECF pH 5.5PicoGreendsDNA quantitation reagent502 nmSYBR Green IRhodaminen Green pH 7.0CyQUANT GR-DNA502 nmNeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNADansylCadaverine335 nmRhodol Gr

28、een antibody conjugate pH 8.0Fluoro-EmeraldNisslFluorescein dextran pH 8.0501 nmRhodamine Green5-(and-6)-Carboxy-2, 7-dichlorofluorescein pH 9.0504 nmDansylCadaverine, MeOH335 nmeYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein)514 nmOregon Green 488Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0Fluo-3506 nmBCEC

29、F pH 9.0501 nmSBFI-Na+336 nmFluo-3 Ca2+506 nmRhodamine 123, MeOH507 nmFlAsH509 nmCalcium Green-1 Ca2+506 nmMagnesium Green507 nmDM-NERF pH 4.0Calcium Green506 nmCitrine515 nmLysoSensor Yellow pH 9.0335 nmTO-PRO-1-DNA515 nmMagnesium Green Mg2+507 nmSodium Green Na+507 nmTOTO-1-DNA514 nmOregon Green 5

30、14512 nmOregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0513 nmNBD-XDM-NERF pH 7.0509 nmNBD-X, MeOHCI-NERF pH 6.0513 nmAlexa 430Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2CI-NERF pH 2.5504 nmLucifer Yellow, CHLysoSensor Yellow pH 3.0389 nm6-TET, SE pH 9.0521 nmEosin antibody conjugate pH 8.0525 nmEosin524 nm

31、6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0526 nm6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride525 nmBodipy R6G SE528 nmBODIPY R6G, MeOH528 nm6 JOE520 nmCascade Yellow antibody conjugate pH 8.0399 nmCascade Yellow399 nmmBanana540 nmAlexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2528 nmAlexa 532528 nmErythrosin-5-isothiocyanate pH

32、9.0533 nm6-HEX, SE pH 9.0534 nmmOrange548 nmmHoneydewCy 3549 nmRhodamine B543 nmDiI551 nm5-TAMRA-MeOH543 nmAlexa 555553 nmAlexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2553 nmDyLight 549555 nmBODIPY TMR-X, SE544 nmBODIPY TMR-X, MeOH544 nmPO-PRO-3-DNA539 nmPO-PRO-3539 nmRhodamine551 nmBodipy TMR-X conjugat

33、e544 nmPOPO-3533 nmAlexa 546562 nmBODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2544 nmCalcium Orange Ca2+549 nmTRITC550 nmCalcium Orange549 nmRhodaminephalloidin pH 7.0558 nmMitoTracker Orange551 nmMitoTracker Orange, MeOH551 nmPhycoerythrin565 nmMagnesium Orange550 nmR-Phycoerythrin pH 7.5565 nm5-TAMRA pH

34、7.0553 nm5-TAMRA549 nmRhod-2552 nmFM 1-43Rhod-2 Ca2+553 nmTetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0552 nmFM 1-43 lipidLOLO-1-DNA568 nmdTomato554 nmDsRed563 nmDapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide372 nmTetramethylrhodamine dextran pH 7.0555 nmFluor-Ruby554 nmResorufin571 nmResorufin pH 9.0571 nmmTa

35、ngerine568 nmLysoTracker Red578 nmLissaminerhodamine572 nmCy 3.5578 nmRhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0573 nmSulforhodamine 101, EtOH578 nmJC-1 pH 8.2593 nmJC-1592 nmmStrawberry575 nmMitoTracker Red578 nmMitoTracker Red, MeOH578 nmX-Rhod-1 Ca2+580 nmAlexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.25

36、79 nmAlexa 568576 nm5-ROX pH 7.0578 nm5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt)578 nmBO-PRO-3-DNA574 nmBOPRO-3574 nmBOBO-3-DNA570 nmEthidium Bromide524 nmReAsH597 nmCalcium Crimson589 nmCalcium Crimson Ca2+590 nmmRFP585 nmmCherry587 nmTexas Red-X antibody conjugate pH 7.2596 nmHcRed590 nm

37、DyLight 594592 nmEthidium homodimer-1-DNA528 nmEthidiumhomodimer528 nmPropidium Iodide538 nmSYPRO RubyPropidium Iodide-DNA538 nmAlexa 594590 nmBODIPY TR-X, SE588 nmBODIPY TR-X, MeOH588 nmBODIPY TR-X phallacidin pH 7.0590 nmAlexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2567 nmYO-PRO-3-DNA613 nmDi

38、-8 ANEPPSDi-8-ANEPPS-lipidYOYO-3-DNA612 nmNile Red-lipid553 nmNile Red559 nmDyLight 633mPlum587 nmTO-PRO-3-DNADDAO pH 9.0Fura Red, high CaAllophycocyanin pH 7.5APC (allophycocyanin)Nile Blue, EtOHTOTO-3-DNACy 5BODIPY 650/665-X, MeOHAlexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2569 nmDyLight 649

39、Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2Alexa 647Fura Red Ca2+Atto 647Fura Red, low CaCarboxynaphthofluorescein pH 10.0600 nmAlexa 660Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2Cy 5.5Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2Alexa 680DyLight 680Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2Alexa 700FM 4-64, 2% CHAPS506 nmFM 4-64508 nm阅读58在看1