高效液相色谱法测定异甘草酸镁中18β

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1、高效液相色谱法测定异甘草酸镁中18p-异构体的含量王善春;顾红梅;张喜全;陈智林;李洋;李军【摘要】目的建立高效液相色谱(HPLC)法测定异甘草酸镁中18P-异构体的含量. 方法色谱柱为 Agilent Extend-C18(4.6 mmx250 mm,5pm),流动相为 0.1 mol?L-1磷酸二氢钾缓冲液(氢氧化钾调pH值至7.0)-乙腈(80:20),流速1.0 mL?min-1,柱温30C,检测波长250 nm.结果异甘草酸镁与180-异构体之间的分 离度2.0,180-异构体的线性范围为0.412.46pg?mL-1(r=0.9998),检测限为 0.21 ng,平均回收率为 10

2、0.2%,99.1%,110.2%,RSD 为 0.9%,0.1%,0.2%(n=3).结 论 该方法操作简便,结果准确,可用于异甘草酸镁中180-异构体的含量测 定.Objective To establish a HPLC method for determination of 180- isomer in magnesium isoglycyrrhizinate. Methods The determination was performed by Agilent Extend-C18 column ( 4. 6 mm x 250 mm, 5 pm ). Mobile phase con

3、sisted of 0. 1 molL-1 potassium dihydrogen phosphate buffer solution ( adjusted to pH 7. 0 with potassium hydroxide )- acetonitrile (80 :20) at the flow rate of 1.0 mLmin-1. The column temperature was 30 C, and the detection wavelength was set at 250 nm. Results The resolution of magnesium isoglycyr

4、rhizinate and 180-isomer was greater than 2.0. The linear range of them was 0.41-2.46pgmL- 1( r=0.9998) , the detection limit was 0.21 ng, and the average recovery were 100.2%,99.1%, 110.2%,RSD were 0.9%,0.1%,0.2%(n=3). Conclusion The method is simple and accurate, and can be used for determination

5、of 180-isomer in magnesium isoglycyrrhizinate.期刊名称】医药导报年(卷),期】2017(036)010【总页数】4页(P1179-1182)【关键词】异甘草酸镁；18异构体;色谱法，高效液相;含量测定【作 者】 王善春;顾红梅;张喜全;陈智林;李洋;李军【作者单位】 正大天晴药业集团股份有限公司研究院,南京 210042;正大天晴药业 集团股份有限公司研究院,南京 210042;正大天晴药业集团股份有限公司研究院,南 京 210042;正大天晴药业集团股份有限公司研究院,南京 210042;正大天晴药业集 团股份有限公司研究院,南京 210042;

6、正大天晴药业集团股份有限公司研究院,南京 210042【正文语种】 中 文【中图分类】 R927.2ABSTRACT Objective To establish a HPLC method for determination of 180-isomer in magnesium isoglycyrrhizinate. Methods The determination was performed by Agilent Extend-C18 column (4.6 mmx250 mm, 5 pm).Mobile phase consisted of 0.1 molL-1 potassium d

7、ihydrogen phosphate buffer solution (adjusted to pH 7.0 with potassium hydroxide)-acetonitrile (80 :20) at the flow rate of 1.0 mLmin-1. The column temperature was 30 C, and the detection wavelength was set at 250 nm. Results The resolution of magnesium isoglycyrrhizinate and 180-isomer was greater

8、than 2.0. The linear range of them was 0.41-2.46 pgmL-1 (r=0.999 8), the detection limit was 0.21 ng, and the average recovery were 100.2% ，99.1%， 110.2%，RSD were 0.9%，0.1%，0.2%（n=3）. Conclusion The method is simple and accurate, and can be used for determination of 180-isomer in magnesium isoglycyr

9、rhizinate.KEY WORDS Magnesium isoglycyrrhizinate ; 180-isomer;Chromatography, high performance liquid； Content determination 异甘草酸镁（magnesium isoglycyrrhizinate ）化学名为 18a,2O0-羟基-11-氧化- 正齐墩果烷-12-烯-3P-基-2-O-P-D-葡萄吡喃糖醛酸基-a-D-葡萄吡喃苷醛酸镁四 水合物1，具有较强的抗炎、保护肝细胞膜、解毒、抗生物氧化及改善肝功能作 用2-3，临床用于治疗慢性病毒性肝炎。从来源看，异甘草酸镁由天然甘

10、草酸经 异构化制得；从结构看，异甘草酸镁与天然甘草酸为差向异构体，区别仅在于前者 18位氢为a-构型，后者为P-构型。两者具有不同的生物活性和理化属性1, 为控制样品纯度和药品的质量与疗效，建立一个良好的18P-异构体（天然甘草酸） 分离和检查方法非常有必要。笔者在本研究采用高效液相色谱（HPLC）法建立异甘 草酸镁中180-异构体的含量测定方法，有效控制异甘草酸镁的质量。1.1 仪器 Agilent Technologies 1260 Intinity （G1314F 1260VWD 检测器， ChemStation Edition工作站）高效液相色谱仪，（美国AGILENT公司）,XP10

11、5 电子天平 （上海梅特勒-托利多仪器公司，感量：0.01 mg）。1.2 药品与试剂 异甘草酸镁对照品（批号：20010718，含量：99.9%），180-异构 体对照品（批号：20010912，含量：99.9%）和异甘草酸镁样品（批号：20010810， 20010811，20010812）均由正大天晴药业集团股份有限公司研究院提供。乙腈为 色谱纯（TEDIA，美国），超纯水（自制）、磷酸二氢钾、氢氧化钾及其他试剂均为市 售分析纯。2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Extend- C18（4.6 mmx250 mm,5 pm）;流动相：0.1 molL-1磷酸二氢钾缓冲液(氢氧化钾调

12、pH值至7.0)-乙腈(80 : 20);流速：1.0 mLmin-1 ;柱温：30 C;检测波长：250 nm ；进样体积：20 pL。2.2 溶液的配制2.2.1对照品溶液精密称取80 C干燥至恒重的18P-异构体10 mg，置于100 mL量瓶中，加流动相溶解并定容。精密量取1 mL ,置于100 mL量瓶中，加流 动相定容，制成1 pgmL-1的溶液，即得。2.2.2供试品溶液精密称取异甘草酸镁样品20 mg，置于100 mL量瓶中，加流 动相溶解成200 pgmL-1供试品溶液，即得。2.3系统适用性实验精密称取异甘草酸镁对照品、18异构体对照品适量，用流 动相溶解并稀释至异甘草酸镁

13、浓度为200 pgmL-1,18p-异构体浓度为20 pgmL-1(相当于主成分的10%)的混合溶液，为试液A(即系统适用性溶液)。量取 20 pL试液A注入液相色谱仪，18异构体与异甘草酸镁的保留时间分别为12.6 和14.0 min，两者的分离度为2.1,以180-异构体计，理论板数为7 140。色谱 图见图1。2.4 线性关系考察 取180-异构体对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成 0.41, 1.64,2.05 , 2.25 ,2.46 pgmL-1的系列溶液。精密量取系列溶液各20 pL,分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C,pgmL- 1)为横坐

14、标，进行线性回归，得线性方程：A=8 857.6C-749.7(r=0.999 8)。线性 范围为：0.412.46 pgmL-1。2.5回收率实验精密称取180-异构体对照品5 mg ,至250 mL量瓶中，用浓度 为200 pgmL-1的异甘草酸镁(未检出180-异构体的精制品配制)流动相溶液溶解 并稀释至刻度。精密量取此溶液8,10,12 mL,每个平行测定3份，分别置于 100 mL量瓶中，用相同稀释溶液定容至刻度，摇匀，作为异构体回收率试验的测 试液。取回收率试验测试液和“221”项的180-异构体对照品溶液各20 pL,分 别注入液相色谱仪，按峰面积以外标法计算回收率。结果见表1。

15、2.6检测限和定量限取“221”项下18P-异构体对照品溶液，适当稀释，进样测 定。当信噪比(S/N)为3时，测得18P-异构体的检测限为0.21 ng ;当信噪比(S/N) 为10时，测得18P-异构体的定量限为0.64 ng。2.7进样精密度实验取“2.3”项试液A 5 mL用流动相定容至50 mL,制成180- 异构体浓度为2 pgmL-1(相当于供试品溶液浓度的1%)的溶液，为试液B。精密 量取试液B 20 pL注入液相色谱仪，连续进样5次，测定180-异构体的峰面积， RSD(n = 5)为 0.2%。2.8溶液稳定性实验取本品(批号：20010811)约10 mg，精密称定，置50

16、 mL 量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液(0.2 mgmL-1)，进 行溶液的稳定性考察。室温下放置0,1,2,4,6,8 h后分别进样20 pL,记录 色谱图，其180-异构体峰面积的RSD(n=6)为0.93%，表明溶液在室温条件下放 置8 h稳定。2.9 重复性实验取同一批样品(批号：20010812),精密称定,加流动相溶解并稀 释，制成浓度为0.2 mgmL-1的供试品溶液6份，分别测定180-异构体含量。 结果180-异构体含量平均值(n=6)为0.36% , RSD为2.6%，表明本法重复性好。2.10 180-异构体含量测定 称取异甘草酸镁样品适量,加溶剂

17、溶解并稀释,制成浓 度约为200 pgmL-1的供试品溶液。精密量取供试品溶液和“221 ”项下的 180-异构体对照品溶液各20 pL,分别进样测定，3批样品中180-异构体含量分 别为0.05%,0.38%,0.36%。3.1 色谱条件的选择 本实验考察不同比例的水-乙腈、甲醇-缓冲盐、乙腈-缓冲盐 等3种流动相体系5。因为两异构体较难分离,仅乙腈-缓冲盐体系有较好的分离 度。异甘草酸镁在流动相中紫外最大吸收波长为250 nm ,180-异构体在流动相 中的最大吸收波长为258 nm。为更准确控制180-异构体，对两者在相同条件下的峰响应进行测定，结果两种异构体之间的峰响应因子相近：18异

18、构体为2.55x10-6，异甘草酸镁为2.53x10-6，故选择检测波长为250 nm。经反复实验， 流动相选0.1 molL-1磷酸二氢钾缓冲液(氢氧化钾调pH值至7.0)-乙腈(80 : 20), 流速1.0 mLmin-1,柱温30 C,检测波长250 nm较为合适。3.2方法耐用性调节色谱条件参数，如：流动相比例、pH值、柱温及流速等，考 察各峰保留时间以及分离度的变化6。实验结果表明：流动相比例与pH值的改 变对保留时间及分离度的影响较为显著。乙腈与缓冲盐比例的微小改变即能使保留 时间产生较大的变化，主峰保留时间延长虽增加分离度，但其峰宽明显增加，峰形 较差。本条件的耐用性较差，需严

19、格按照所定条件进行实验。3.3 系统适用性实验的选择 配制系统适用性实验测试液时，考虑到若异甘草酸镁 与180-异构体浓度相似，分离度不能合理地反映高浓度供试品溶液中含少量杂质 时的分离情况刀。故配制相当于主成分10%的180-异构体混合液来测试分离度， 验证系统适用性。【相关文献】1 SUN L，SHEN J F，PANG X Y，et al.Phase I safety and pharmacokinetic study of magnesium isoglycyrrhizinate after single and multiple intravenous doses in Chines

20、e healthy volunteersJ.J Clin Pharmacol，2007，47(6)：767-773.2 CHEN K J，CHEN W Y，CHEN X，et al.Increased elimina-tion of paclitaxel by magnesium isoglycyrrhizinate in epithelial ovarian cancer patients treated with paclitaxel plus cisplatin：a pilot clinical studyJ.Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2014，39(

21、1)：25- 31.3 CHENG Y，ZHANG J，SHANG J，et al.Prevention of free fatty acid-induced hepatic lipotoxicity in HepG2 cells by magnesium isoglycyrrhizinate in vitroJ.Pharmacology ， 2009，84(3)：183-190.4 XIE C F，LI X T，WU J S，et al.Anti-inflammatory activity of magnesium isoglycyrrhizinate through inhibition of phospholipase A2/arachidonic acid pathwayJ.Inflammation，2015，38(4)：1639-1648.颜庙，张金娇，李焕德，等.RP-HPLC法同时测定甘草酸制剂中18a-,18B-甘草酸的含量J. 药物分析杂志，2012，32(2)：301-304.潘玉杰，蒋坤，夏文，等岩陀中岩白菜素含量测定J.医药导报，2016，35(10) : 1130-1133.7陈英对HPLC法有关物质系统适用性建立的体会和建议J.中国药品标准，2010，11：323- 324.