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1、高效液相色谱法测定侧柏叶中槲皮素含量更新日期：2010-08-15 点击： 仲 英 孙立立提要 采用高效液相色谱法测定侧柏叶中槲皮素的含量。方法简便、专属性强、重现性好， 可作为侧柏叶的质量控制方法。关键词 侧柏叶； 槲皮素； 高效液相色谱侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis(L) Framco.的干燥嫩枝及叶，是中医 临床常用凉血止血、镇咳祛痰药物，为中国药典历版收载品种。侧柏叶所含主要成分为 黄酮类化合物，鞣质和挥发油类等。其中镇咳祛痰和止血的主要有效成分为黄酮类化合物中 的槲皮甙类。黄酮类成分结构比较复杂，一般方法较难将它们分开，目前常用的分析方法多 为以芦丁
2、为对照品采用紫外分光光度法测定侧柏叶中的总黄酮含量，因芸香甙(芦丁)与侧柏 叶中黄酮类主要成分槲皮甙结构上有所不同，在吸收波长上也有所差异，不能正确地反映出 侧柏叶的内在质量。而能够正确反映侧柏叶内在质量的含量测定方法目前尚未见报道。本文 选用反相高效液相色谱法，以槲皮甙甙元槲皮素为指标，建立了侧柏叶含量测定方法。实验 表明，该法准确、灵敏、快速简便，所选指标槲皮素能够准确地反映侧柏叶的内在质量，可 作为侧柏叶质量检测的定量方法。1 仪器和试剂、材料1.1 仪器：美国Waters高效液相色谱仪；Lambda-Max M481检测器；745 Data Module数 据处理机；U6KW/Haus
3、ing 进样器；Millipore MILLIQ-2 超纯水制备仪；Resolve C18 (8X100 mm) 径向加压色谱柱。1.2 试剂均为色谱纯、分析纯。1.3槲皮素标准品：美国SIGMA公司。1.4 侧柏叶样品：购自济南、潍坊、烟台、青岛药材站。2 方法与结果2.1色谱条件：流动相为甲醇-0.5%磷酸溶液(45： 55)；流速1 ml/min；检测波长368 nm； 进样量10 p l；数据处理机外标法计算含量。2.2 不同提取方法的比较：侧柏叶中槲皮甙需经酸水解才能准确测定槲皮素的含量。因此对 不同的水解条件进行了槲皮素含量的比较。2.2.1不同浓度的酸对槲皮素含量的比较：精密称取
4、侧柏叶lg,分别按下列方法提取：加 60%甲醇50 ml,分别加3%, 4%, 5%, 6%, 7%盐酸50 ml加热回流1 h,放冷，过滤。用甲醇 定量转入100 ml容量瓶中并稀释至刻度。用0.5 p m的滤膜过滤，按色谱条件测定槲皮素含 量。结果表明, 3%, 4%的盐酸对槲皮甙水解不完全, 5%, 6%, 7%的盐酸基本水解完全,槲皮 素含量无显著性差异,故选用 5%的盐酸进行水解提取。定量分析结果见表1。2.2.2不同水解提取时间对槲皮素含量的影响:精密称取侧柏叶1 g,分别加60%甲醇50 ml, 5%盐酸50 ml,按不同时间进行水解提取，按色谱条件测定含量。结果表明1 h即可水
5、解完 全。结果见表 2。表 1 不同浓度的酸水解对槲皮素含量的影响( n=3)水解条件 槲皮素含量(%)3% 盐酸 0.2034% 盐酸 0.2515% 盐酸 0.3216% 盐酸 0.318 7% 盐酸 0.3表 2 不同水解时间对槲皮素含量的影响( n=3)水解时间 槲皮素含量(%)15 min 0.22330 min 0.2761 h 0.3221.5 h 0.3192.3标准曲线制备：精密称取槲皮素标准品2.5 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释 至刻度，摇匀，得对照品溶液。用微量进样器分别吸取不同体积的标准品溶液进样，以进样 量为横坐标，峰面积为纵坐标作出校正曲线，呈良好线性
6、关系。计算得回归方程 Y=827836 X+5436,相关系数Y =0.9999。槲皮素进样量在0.251.25 p g时，与峰面积呈良好的线性 关系，且通过原点，可用外标一点法计算。2.4精密度测定：精密量取对照品溶液10 p l,按色谱条件进样6次，测得槲皮素峰面积 Y=4121026,RSD=1.1% ( n=6)。说明本方法精密度很好。2.5 加样回收率试验：精密称取已知含量的供试样品，精密加入一定量对照品，按样品测定 方法测定6次，测得槲皮素的添加回收率。回收率为98.17%,RSD=2.1。结果见表3。2.6样品含量测定：精密称取供试样品1 g,按5%盐酸水解1 h方法制备样品供试
7、液。取供 试品溶液，按色谱条件进样测定，数据处理机外标法计算含量。各种不同样品的含量测定结 果见表 4。槲皮素对照品、侧柏叶样品高效液相色谱图见图1，图 2。表 3 加样回收率试验结果 槲皮素 加入量(mg) 检出量(mg) 回收率 (%) 平均回收 率(%) RSD(%)11.241.20397.0221.231.2097.6431.241.268102.25 98.17 2.141.221.19597.9551.221.19397.7961.241.19596.373 小结与讨论3.1 侧柏叶中主要黄酮类化合物为槲皮甙类，其甙元为槲皮素。经酸水解后，以高效液相色 谱法测定槲皮素含量，方法简便易行，结果稳定，重现性好，专属性强，是一种可靠的含量 测定方法，可准确地反映出侧柏叶的内在质量。3.2 在测定过程中发现，不同产地的药材中槲皮素含量有所差异，以济南、潍坊地区的侧柏 叶质量较好。表 4 侧柏叶中槲皮素的含量测定样品来源 批次 含量(%) RSD(%， n=5)济南 1 0.32 1.52 0.30 1.3潍坊 1 0.33 1.92 0.31 2.1烟台 1 0.20 1.42 0.19 1.6青岛 1 0.16 1.62 0.17 1.9作者单位：仲 英 山东省医学科学院药物研究所，济南 250062孙立立 山东省中医药研究所，济南 250014
高效液相色谱法测定侧柏叶中槲皮素含量
