补体结合试验操作规程

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1、补体结合试验操作规程试剂：稀释液（0.85%生理盐水）、补体、溶血素、抗原（由生物制品厂 或所提供）、阴阳性血清、 2.5%绵羊红细胞悬液、受检血清。（共七 种）材料准备：1、稀释液（0.85%生理盐水）的配制： 8.5g 氯化钠加蒸馏水至 1000ml。2、绵羊红细胞悬液的配制：由健康成年公绵羊颈静脉采血，流入灭菌含玻璃珠的玻璃瓶内，混摇1520 分钟，脱除纤维，使其失去凝固 性。将脱纤血移入离心沉淀管中，加 2-3 倍量的生理盐水混匀， 以每分 2000 转的速度离心沉淀 10 分钟，使红血球下沉，吸弃上 清液，再加生理盐水用玻棒搅匀再离心沉淀，反复三次，直至上 清液透明为止，最后吸弃上清

2、液，所剩沉淀即为红细胞。按每 2.5 毫升的沉淀红血球加入到97. 5 毫升生理盐水中的比例制备， 便为 2.5%绵羊红细胞悬液。此液配制后在 5100C 下，24 小时内 可应用。若发现有溶血时，需重新配制。经常做补体结合试验， 就迫切需要能将红血球保存。方法是：将无菌的脱纤维蛋白的绵 羊血与无菌的等量的改良的阿尔塞维尔氏液混合于三角瓶中（用 三角瓶有利于扩大血球与空气的接触面积），置冰箱中冷藏可保存 达两个月。需用时将血球离心洗涤后即可应用。改良的阿尔塞维尔氏液配法：葡萄糖 24.60 克，氯化钠 5.04 克，柠檬酸 钠（含 2 分子的结晶水）9.6 克，蒸馏水 1200 毫升，10 磅

3、 10-15 分钟高压消毒后保存。抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素、补体、由制标单位提供，按 说明书使用。受检血清的收集和处理：以常规方法采血和分离血清，若发现血清混浊 或有血细胞混在时，离心沉淀，每分 1000 转后将上清液分离出来 然后用稀释液将血清作1: 10稀释，按下表规定的水浴灭能。各种被检动物血清的灭能温度和时间血清类型灭能温度（C）灭能时间/min羊58-5930马58-5930驴、骡63-6430黄牛、水牛、猪56-5730鹿、骆驼5430兔63 （有书说为56）30豚鼠57-5830人56-5830狗6330操作方法：1.将1 ： 10稀释经灭能的受检血清加入2支三分管内

4、，每管 0.5ml。2. 其中一管加工作量抗原0.5m 1,另一管加稀释液0.5ml。3. 上述2管均加工作量补体，每管0.5ml，震荡摇匀。4. 置37C38C水浴20分钟，取出放于室温（22C25C）。5. 每管各加2单位的溶血素0.5ml，和2.5%红细胞悬液0.5ml， 充分震荡摇匀。6. 再置37C38C水浴20分钟，之后取出立即进行第一次判定。7. 每次试验需设阳性血清、阴性血清、抗原、溶血素和补体对照。 被检血清和对照血清均应灭能，要注意的是各材料（特别是补体）， 从预备试验到正式试验，所用的溶血素、血球、补体、抗原、已 知阳性血清及已知阴性血清，都必须是同一批，决不能中途更换

5、另一批，所用补体如为新鲜的豚鼠血清，则从预备试验到正式试 验必须在 24 小时内做完，以免补体失效。主试验各要素添加量和 顺序如下表：布鲁氏菌病补体结合试验被检I血清 1： 10阳性血清对照阴性血清对f照其他对照管补体对照1234567891011121314150.5单位1单位2单位1 : 10血清0.50.550.50.50.50.50.50.5000000000抗原0.5000.5000.50001.01.00000.50.50.5补体0.50.500.50.500.50.50.00.50.501.0000.1250.250.5生理盐水00.5100.51.000.51.01.000.5

6、0.51.51.00.8750.750.5置37 C水浴中30分钟溶血素0.50.500.50.500.50.500.50.50001.00.50.50.5绵羊红血 球0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5生理盐水000.5000.5000.5000.50.50.50000置37 C水浴中30分钟各对照管 应有结果看 试 验 结 果宀完 全 溶 血+宀 完 全不溶血+宀 完 全不溶血宀完 全 溶 血+宀 完 全不溶血宀完 全 溶 血宀完 全 溶 血+宀 完 全不溶血宀完 全 溶 血宀完 全 溶 血+宀 完 全不溶血+宀 完

7、全不溶血+宀 完 全 不 溶 血+宀 完 全 不 溶 血-+宀 完 全不溶血+半 溶 半 不 溶完全 溶血每做一个被检血清，就要做三管（即表中的1、2、3 管），其中 1 是正式管，结果应是：溶血百分数记录为结果是0-10%+强阳性反应10-40%+阳性反应40-50%+弱阳性反应50-70%+可疑反应70-90%土可疑反应90-100%一阴性反应判断被检血清的结果，就是看第1 管，但是有一先决条件，即2-18各对照管均合理想，如表中各对照管应有结果所表示的才行。第二管是检查被检血清是否抗补体，这管中没有抗原，所以无论什 么血清都不能结合补体，补体应余留下来给溶血系而引起溶血，若这一 管不溶血

8、，而溶血系又是没有问题的，说明这个血清有抗补体作用，这 个血清不能用，或者将血清再加热或进行其他处理，使该血清的抗补体 作用消失后再用。第三管是检查被检血清是否溶血，其中只有血清、血球、盐水，应 不溶血，若溶血而生理盐水又没有问题，说明血清本身就能引起溶血， 这个血清不能用。4-18 管是各项对照管，无论做多少个被检血清都得做这样的一套对 照管（共计15 管），其中4-6 管是已知阳性血清的对照，7-9 管是已知阴 性血清的对照，4、7 两管性质与1管相似，5、8两管性质与2管相似， 6、9 两管性质与 3 管相似，10 管是溶血系健全与否的对照，11 管是抗原 抗补体与否的对照，12 管是抗

9、原溶血与否的对照，13 管是补体溶血与否 的对照，14 管是盐水溶血与否的对照，15 管是溶血素本身（在没有补体 的情况下）是否能引起溶血，16、17、18 管是不同补体量的对照。第一次进水浴箱前，所有试管均内含 1.5 毫升，第二次进水浴箱前 每管均内含2.5 毫升。进水浴箱前看一看，量过多或过少的管子，都说明 操作时有问题，及时找得出原因的改正，找不出原因的重做。第二次进水浴箱前，各管红血球一定要完全混合好，混合不好得不 出正确结果。水浴箱温度要正确，取试管架出水浴箱时不能将水滴在箱内的其他 试管，水一进试管，试管内的血球就可能溶解，结果便不可靠。第二次置水浴箱中 30 分钟后取出，先检查

10、对照管，若对照管结果 与表中所述完全相符，可作正式试验的第一管的第一次检查，再置室温 12 小时（避免日光、灰尘、振荡）作第二次检查，检查时与标准溶血管 作比较（标准溶血管配法见后）。第二次检查时由于未溶解的血球下沉， 上液的溶血程度能做较好的判断。但夏日室温高，经静置12 小时后管内 可能发生溶血，尤其是底部更明显，这点因素一避免，应置于冷处，或 将试管架浸于冷水中。标准溶血管的制备：应在进行本试验的同时配制，所用试验管的管 径大小和管壁厚薄，以及各种成分，都必须与本试验时使用者相同。2.5%溶血红细胞液的配制：取沉积红细胞2.5 毫升加于47.5毫升蒸 馏水内，使红细胞完全溶解后，添加 1

11、.7%盐水 50 毫升，制成 2.5%溶血 红细胞液。然后再用生理盐水稀释5 倍，即成0.5%的溶血红细胞液。为 方便计，也可将当日测定补体及溶血素时，完全溶血的各管溶液收集起 来，供作配制标准比色管用。5%红细胞液悬浮液的配法：取 2.5%的红细胞液 2.5 毫升，加生理盐水 10 毫升即成。按下表配制各浓度的标准比色管，摇匀后放置室温下，供第二天终判时比色用。标准比色管的配制溶血程度（） 成分（毫升）1020304050607080900.5%溶血红细胞液0.250.500.751.001.251.501.752.002.250.5%红细胞悬液2.252.001.751.501.251.0

12、00.750.500.25标准比色管的配制方法及反应判定标准溶血率及管号0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%量成分J1234567891011溶血溶液0.10.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.5%红细胞悬液0.500.451.400.350.300.250.200.150.100.050生理盐水2.001.801.601.401.201.000.800.600.400.200判定符号+一判定标准阳性可疑阴性试验中全溶血的试管内液体即为溶血红细胞标准溶血管的制备：1. 取沉淀血球 1.25 毫升加于蒸馏水98.75 毫

13、升中，使血球完全溶解，再 加入氯化钠0.85 克，制成1.25%生理盐水溶血液。2. 取沉淀血球 1.25 毫升加于 0.85%生理盐水 98.75 毫升中制成 1.25%生 理盐水红血球悬浮液。3. 按下表加入各成分，即成不同溶血百分率的标准溶血管，并与正式试 验管同置室温 12 小时，然后与试验管比较。标准溶血管的制备表溶血率及管号0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%量成分12345678910111： 10健马血清0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5抗原1单位0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5溶血

14、素2单位0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.51.25%生理盐水溶血液00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.25%红血球悬液1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10判定标准：+：无溶血，红细胞沉于管底或为悬浮。 +：25%溶血。+：50%溶血，上清随不同程度溶血，成不同深浅颜色。+：75%溶血，透明度亦不同。：100%溶血，上清透明，呈深红色。 为防止判定错误，可配制溶血标准管。40%溶血判为阳性反应，5090%溶血判为可疑反应，100%溶血判 为阴性反应。牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。血清稀释度管号血清（毫升）生理盐水（毫升）稀释液11.09.01： 1020.49.61： 2530.29.81： 5040.2 或 0.114.8 或 7.41： 7550.19.91： 100