细胞冻存和复苏

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1、细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代 保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶 性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相 反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过 程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存方法预先配制冻存液： 20%血清培养基10%DMSO （二甲基亚砜） 取对数生长期细胞 1ml 于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液， 用吸管吹打制

2、成细胞悬液（1X1065X 106细胞/ml）,密封后标记冷 冻细胞名称和冷冻日期。慢冻程序标准程序（放哪里？）当温度在-25 C以上时，1-2 C/min当温度达-25 C以下时，5-10C/min当温度达-100C时，可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4C放置1小时，于-20C放置1小时，通过线绳将 装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70C）,放置1小时，后直 接投入液氮中（-196C）细胞复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37C水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！5 分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 低温保

3、护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细 胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内 水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减 少冰晶对细胞的损伤。注意事项： 在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。 高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下， DMSO 对人体有毒，故在配制时最好带手套。在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐 内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻 手套、面罩、工作衣或防冻鞋

4、。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还 要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细 胞冻存一段时间后，要复苏12管，以观察其活力以及是否受到微 生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要 从-196 C的液氮中取出冻存管，立即投入37C温水中，温差很大， 玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混 入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物 （真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质和细胞（非同一种的其他 细胞）。微生物污染的途径 空气：微生物传播的最主要途径

5、。器材：清洗消毒不彻底。 操作：无菌观念不强，操作不规范。血清：支原体或病毒污染。 组织样本：造成原代培养污染。微生物污染对细胞的影响 体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力； 培养基中加入的抗生素的抗污染能力有限； 培养细胞一旦发生污染，多数将无法挽救； 污染早期或污染程度较轻时，及时处理，部分细胞有可能恢复。 污染物持续存在对细胞的影响： 轻者细胞生长缓慢，分裂相对减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞质 中出现较多的颗粒状物质； 重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量的堆积物，细胞变 圆或崩解，从瓶壁脱落。微生物污染的检测真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进 行细

6、胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孢子霉、毛 霉菌、白色念珠菌和酵母菌等。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小 点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、 管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排 列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小， 有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶 外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但 最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液 中加入了抗菌素 （一般为预防剂量 ）

7、，也可能因为操作不慎而引起污 染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌 等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以， 每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗， 最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株（系）丢失。支原体污染 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小 直径0.2“m, 般过滤除菌无法去除干净，光镜下难以看清它的形 态结构。开始不易发现，能在偏碱条件（pH7.6 8.0）下生存，对青霉 素有抗药性。多吸附于细胞表面

8、或散在于细胞之间。电镜下可见其有 三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变 慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或 略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。病毒污染 采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织 培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不 少于 20 种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生 产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴 细胞含EB病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。 因此，潜在病毒是细胞大量

9、生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的 难题。非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分 开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类” 细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物。目前，世界上已有几十种细胞都 被 HeLa 细胞所污染，致使许多实验宣告无效。化学成分的污染 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由 于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。 污染的鉴别1、细菌、真菌污染的检测（1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性 操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在 48 小时内可明显观察 到。如培养液变混浊，

10、或略加振荡有很多漂浮物漂起。（2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球 状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵 形的物质常为真菌污染。（3）接种观察 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接 种，也可发现是否有污染。支原体污染的检测（1）相差显微镜观察 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物 （一般用长形盖玻 片），24 小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放 置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物 培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支 原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见

11、类似 于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区 别（2）低渗溶涨处理地衣红染色观察 固定染色法，通过对细胞低渗处理，使细胞体积扩张，细胞膜 表面的褶皱和结构减少，使附在细胞表面的支原体容易被识别。取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的 0.5% 枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配制的Carnoy液固定两次，每次10 分钟，取出盖片凉干。用培养液时，先吸取ImL, 500800r/min离 心5分钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中，置 10分钟，加入Carnoy液固定，离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物， 制成23张涂片。然后用2%醋酸地衣红（地

12、衣红2g,冰醋酸60mL， 加蒸馏水至100mL ）染5分钟。纯酒精过三次，每次1分钟,圭寸入Euparal 或树胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色，再封片。镜下观察见 支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。（3）荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为： 用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满 前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾 固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置于50 “ g/mL的Hoechst33258（生 理盐水配制）中染色10

13、分钟，置于蒸馏水漂洗12分钟，向细胞面 滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培 养液，先离心去除上清液，再加入 Hanks 液漂洗，离心弃上清后加入 1:3 醋酸甲醇固定 10 分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用 Hoechst33258染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水， 加 35 滴 pH5.5 磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸 出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈亮绿色 小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。（4）电镜检测 若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一 般在细胞培养4872小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化

14、细胞制成 细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方 法同细胞形态观察法。（5）培养检测 将2.5X109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤 培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉 汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50C的培养基中， 再用琼脂培养基做分离培养，37C培养3天观察有无“荷包蛋”菌落 出现。污染的清除和预防污染的清除培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大， 宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作 室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重 新得到，可采取以下办法

15、清除。1 、使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防 用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素 （青霉素 100u/mL加链霉素100“g/mL）,污染后清除用药需采用大于常用量5 10倍的冲击处理，于加药后作用 2448 小时，再换常规培养液。 此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还 可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400-800M g/mL卡那霉素或200p g/mL四环素处理，每隔2-3日换 液 1 次，传 1 2 代进行治疗。2、加温处理将污染的组织培养物放在41C培养18小时，可杀死支原体， 但对细胞有不

16、良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度 杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用 药物处理后，再以41C加温处理效果更佳。3、使用支原体特异性血清用 5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑 制支原体生长，故经抗血清处理后 11 天即转为阴性，并且5 个月后 仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。4、其他方法 除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法 等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别 重要价值，一般均弃之重新培养。污染的预防 预防是防止细胞

17、培养过程中发生污染的最好办法。只有预防 工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从 以下几方面着手：1 、从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔 细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期 清洁消毒灭菌。2、从操作者做起（1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室 前要用肥皂洗手或用 5%新洁尔灭浸泡 5 分钟，按规定穿隔离衣。进 入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用 75%酒精棉球擦手、 擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污 染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便

18、使用，以免造成大 批污染。（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶 口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。（3）操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口 接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清 洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。3、防止细胞交叉污染 在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便 于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。 在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口， 以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种

19、冻存， 一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。基础篇-细胞冷冻保存 （一）1. 注意事项：1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好 （log phase） 且存活率高之状 态，约为80 - 90 %致密度。1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如 hybridoma 应在 冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。1.3. 注意冷冻保护剂之品质。 DMSO 应为试剂级等级，无菌且无 色（以 0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如 Sigma D-2650），以510 ml小体积分装，4C避光保存，勿作多次解冻。 Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压

20、蒸汽灭菌后避光保存。在开启后 一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。1.4. 冷冻保存之细胞浓度：1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml， 细胞浓度不要太高， 某些 hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻 24 小时后死去。1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106 ， 依 细 胞 种 类 而 异 。 Adenocarcinoma 解 冻 后 须 较 高 之 浓 度 ， 而 HeLa 只 需 1-3 x 106cells/ml。

21、1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少 5 x 106cells/ml。1.5.冷冻保护剂浓度为5或10 % DMSO,若是不确定细胞之 冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止 冷冻失败。1.6. 冷冻方法：1.6.1. 传统方法：4C 10 分钟- -20C 30 分钟- -80C 16 - 18 小时(或隔夜) - 液氮槽 vapor phase 长期储存。1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以-1 - -3C/分钟之速度由室温降 至-120C,放在液氮槽va

22、por phase长期储存。适用于悬浮型细胞与 hybridoma 之保存。基础篇-细胞冷冻保存 (二)2. 材料：2.1. 生长良好之培养细胞2.2. 新鲜培养基2.3. DMSO (Sigma D-2650)2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)2.5. 0.4 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)2.6. 血球计数盘与盖玻片2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)3. 步骤：3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将 DMSO 加入新鲜培养基中

23、, 最后浓度为 5-10,混合均匀,置于室温下待用。3.3. 依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约 0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/m 1,混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。3.5. 冷冻保存方法1:冷冻管置于4C 10分钟一-20C 30分钟一 -80C 16-18小时（或隔夜）一液氮槽vapor phase长期储存。3.6. 冷冻保存方法 2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放 入液氮槽中。程序为:

24、program 7: HB CELL基础篇-冷冻细胞活化1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞 造成伤害，导致细胞之死亡。2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表 现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。3. 材料37C 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶，液氮或干 冰容器。4. 步骤：4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀 冷缩过程，此时盖子易松掉。4.3 将新鲜培养基置于 37 C 水槽中回温，回温后喷以 70 % 酒精 并擦拭之，移

25、入无菌操作台内。4.4 取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使 其在 1 分钟内全部融化，以 70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无 菌操作台内。4.5 取出 0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内（稀释比例1:101:15）,混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。4.6解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DMSO或glycerol）,依细 胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立 即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有 5-10 ml 培养基之离心管 内,离心1,000 rpm, 5 分

26、钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均 匀,放入 CO2 培养箱培养。4.7 若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。 基础篇-收到细胞的处理方式 （一）1. 收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形, 若有 请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存（置于-70 C, 隔夜后,移到液氮）。2. 冷冻细胞解冻程序:2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定 之成份和比例制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基 础培养基或不同之血清种类,若因实验需要,必须有所不同时,务必 以缓慢比例渐次改变培养基组成,确定细胞适应后,方进行所需之实

27、 验。2.2. FBS （fetal bovine serum, 胚牛血清）, CS （calf serum, 小牛血清）和 HS （horse serum, 马血清），对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株 资料单指定之血清种类培养之。2.3. 将培养基置于37 C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦 拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入 37 C 水槽中 快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污 染。轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化后， 以 70 % ethanol 擦拭 冷冻管外部，移入无菌操作台内。2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10

28、ml培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25或T75 flask 内之培养基，混合均匀，放入 37 C， 5 % CO2 培养箱培养。2.5. 对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO,不会对细 胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天 确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO敏 感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO者，则可将解冻后 之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg （约1000 rpm）， 5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中

29、，再放入37 C， 5% CO2 培养箱培养。 基础篇-收到细胞的处理方式 （二）收到T25 flask细胞时，处理方式为：1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡， T25 flask 均加满 培养基。请检查 flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无 污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。2. 将原封之 T25 flask 静置于 37C， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37 C,并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天 后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，（取出之培养基可以再使 用），仅留约5-10ml培养基于flask内，依一般培养方式再将细胞置 入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。