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1、11、PCR技术2、RT-PCR技术3、RFLP4、SSCP5、MSP6、测序21、细菌、支原体、衣原体、寄生虫、病毒等2、SARSSARS冠状病毒的分子生物学检测冠状病毒的分子生物学检测345BNIoutS/BNoutAs:sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp BNIinS/BNIAs:sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fra
2、gment length 110 bpSAR1s/SAR1as:sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp6Amplicon sequence(BNI-1,Bernhard-Nocht Institute,Hamburg,Germany)TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGG
3、ATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC7SARS-specific primers:Cor-p-F2(+)5CTAACATGCTTAGGATAATGG 3,Cor-p-F3(+)5GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3,Cor-p-R1(-)
4、5CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3,Product size:Cor-p-F2/Cor-p-R1:368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1:348 bp8Government Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre 382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon,Hong Kong SAR Hong Kong-SAR China COR-1,COR-2:sense 5 CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3 antisense 5 AAA TGT
5、TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3 Product size:310 bp9Queen Mary Hospital The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong-SAR ChinaHKU:sense 5 TACACACCTCAGCGTTG 3 antisense 5 CACGAACGTGACGAAT 3 Product size 182 bps101、临床基因变异酶的分子性质研究 1）用PCR-SSCP技术发现我国第一例 LDH遗传变异病例11 病 例 21岁男性：LDH：75 U/
6、L (参考范围：110-240 U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在 48-8548-85 U/L之间12 经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。1314 基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状
7、态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。15 LDH-A基因变异类型基因变异类型_变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失A-220 AAA-GAA Lys-Glu 电荷变化A-314 CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化A-20 插入C 移码突变A-128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合A-213 丢失2 bp(CT)移码突变A-251 丢失20 b
8、p 移码突变16 LDH-BLDH-B基因变异类型基因变异类型变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响 B-6 AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化B-35 GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合B-103 8bp重复 移码突变B-131 AGT-CGT Ser-Arg 辅酶结合B-139 丢失2 bp(TC)移码突变B-145 4bp重复 移码突变B-147 TAT-TAG Tyr-Ter 无义突变B-171 CGC-CCC Arg-Pro 基质结合B-172 TTT-GTT Phe-Val 基质结合B-173 CGC-CAC Arg-His P轴的安定性B-176 ATG-TTG Met
9、-Leu 分子稳定性B-287 丢失1bp(C)移码突变B-320 GAT-GTT Asp-Val 电荷变化 17病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科 心电图和临床症状提示AMI实验室检查：LDH 6900 U/L (200-400 U/L)LDH-1/LDH-2 1.72 CK 37 U/L(15-130 U/L)CK-MB 0 U/L 18 RT-PCR结果 1920外显子2 残基54处 A G GAC GGC 天冬氨酸 甘氨酸 位于酶结构的第4个-螺旋21 结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范
10、围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；221）2、2、电泳异常带的分子性质研究23 M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 (+)LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1 正常 H 缺失 M 缺失 H 变异(slow)H 变异(fast)24 H 发生变异时，产生H 和h M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1 H1M3 h1M3 H2M2 H4 h2M2 h1 H3 hHM2 h2 H2 h3 H1 h4 252627 1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，3）变异的氨
11、基酸位于分子的表面。结果：产生异常的电泳结果28 29LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型 异常谱型 免疫对流、固定、混合法鉴定 遗传变异（H或M亚基变异）（+）（-）LDH-Ig复合物 肿瘤产生LDH 基因分析 30-LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5H亚基数 4 3 2 1 0M亚基数 0 1 2 3 4%A B C D E-计算方法：H=A+3/4 B+2/4 C+D M=100-H H/M=H/(100 H)3132 DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。3334 3536 病例 4岁儿童 遗传性Rb 转移到颈淋巴结 血清LDH 升高 异常同工酶带LD2ex 位于 LD1和LD2之间373839404142 DNAmRNA1 mRNA2aa001 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 74344
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