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1、蛋白质结构测定 2011-3-30 蛋白质三维结构测定方法及数量 蛋白质三维结构测定年增长图 第一节： X-射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定 原理 基本过程 优缺点 应用实例 一、相关原理 光的衍射现象 X射线的发现及应用 本质的争论 X射线衍射的发现 晶体学基础知识 X射线晶体衍射 ? S 光线 拐弯了！ 1.光的衍射现象 衍射现象：光波偏离直线传播而出现光强 不均匀 分布的现象 E S E S 当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长相差不多时就 发生明显的衍射现象如果缝很宽，其宽度远大于波 长，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象 就很不明显了 惠更斯 菲涅耳原理 菲涅耳 补充：从同
2、一波阵面上各点发 出的子波是相干波。 1818年 惠更斯： 光波阵面 上每一点都可以看 作新的子波源，以 后任意时刻，这些 子波的包迹就是该 时刻的波阵面。 1690年 解释不了光强分布！ 2. X射线的发现历程及应用 失之交臂 1836 法拉第 发现阴极射线 1861 克鲁克斯 阴极射线管在放电时会产生亮光 干 版和光片有问题？ 1890 古德斯柏德 洗出了一张 X射线的透视底片 照 片的冲洗药水或冲洗技术 发现 X射线 本质的争论 X射线衍射 2.X射线的发现及应用 1895年 伦琴（ Roentgen）发现故称为伦琴射线。 伦琴夫人的手的 X射线照片 X射线在医学上的应用 伦琴的新发现轰
3、动了全世界 , 不到三个月 , 维也纳的一 家医院便拍出了应用于医疗的 X射线照片 .从此 , X射线 拍片和射线透视成为医学诊疗中常用的手段。 为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便 , 科 学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器。 1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像重 建理论 , 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置 , 也 就是已被广泛应用的 CT。 X射线与诺贝尔奖 物理学奖 伦琴因发现 X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。 1903 年诺贝尔物理学奖。 1906 年的诺贝尔物理学奖。 劳厄获得了 1914 年诺贝尔物理学奖。 英国的布拉格父子 1915 年的诺
4、贝尔物理学奖。 英国的巴克拉 1917 年的诺贝尔物理学奖。 瑞典物理学家西格班 1924 年诺贝尔物理学奖。 美国的康普顿 1927 年诺贝尔物理学奖。 前苏联的切连科夫 1958 年诺贝尔物理学奖 ; 美国的霍夫斯塔特 1961 年诺贝尔物理学奖 ; 瑞典的西格巴恩 1981 年的诺贝尔物理学奖。 化学奖 荷兰的物理化学家德拜 1936 年诺贝尔化学奖。 美国著名化学家鲍林 1954 年诺贝尔化学奖。 英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨 1962 年诺贝尔化学奖。 英国女化学家霍奇金 1964 年诺贝尔化学奖。 美国化学家利普斯科姆 1976 年诺贝尔化学奖。 英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特
5、1980 年诺贝尔化学奖。 英国生物化学家克卢格因 1982 年诺贝尔化学奖 ; 美国化学家豪普特曼和卡尔 1985 年诺贝尔化学奖 ; 1988 年 ,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔化学奖。 3.X射线本质的争论 X射线本质的争论 -波动说 巴克拉： X射线波动性 标识谱线： 不管元素已化合成什么化合物，它们总是发射一种硬度的 X射线， 当原子量增大时，标识 X射线的穿透本领会随着增大。这说明 X射线具有标识特 定元素的特性。 X射线本质的争论 微粒说 X射线微粒论者 粒子具有旋转性 布拉克父子 4.X射线衍射 X射线衍射的获得 波长范围： 100.1埃 欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波
6、长差不多，晶体的晶格常 数恰是这样的线度 衍射波的两个基本特征 衍射线（束）在空间分布的方位（衍射 方向）和强度与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切相关。 X射线晶体结构分析？ 使用 X射线作为物理 工具 ，依赖 X射线衍射现 象为物理 原理 ，以晶体作为研究 对象 ，晶体结 构作为研究 结果 的一种分析方法。 5.X射线的获得： X射线管 激光等离子体 同步辐射 X射线激光 6.晶体基础 什么是晶体 晶体的周期排布 晶体的对称性 3.1什么是晶体 固体物质 晶体 相当罕见的东西？ 非晶体 晶体 (Crystal ) 指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复 排列形成的、 能够给出明锐
7、衍射的固体 结构。 晶体什么样（ 1） 晶体什么样（ 2） 晶体什么样（ 3） 晶体什么样（ 4） 2.晶体和点阵结构 晶体的周期性结构使得我们可以把它抽象成 “点阵”来研究 . 一维周期性结构与直线点阵 二维周期性结构与平面点阵 三维周期性结构与空间点阵 一维周期性结构与直线点阵 二维周期性结构与平面点阵 三维周期性结构与空间点阵 晶胞 (Unit cell) 空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体）， 是晶体结构的最小单位。 同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。 选择平行六面体的 原则 ： 所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。 选择棱与棱之间直角关系为最
8、多的平行六面体 所选平行六面体之体积应最小。 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距 小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六 面体。 单位平行六面体， a、 b、 c 、 、 、 是表征它本身形状、 大小的一组参数，称为 格子参数或点阵参数 。 c a b 单位平行六面体参数 单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角 坐标轴之间 交角 。 a、 b、 c 轴单位 。 a、 b、 c、 、 、 关系有 七种情况 ，与单位平行六面体 七种格 子相对应 。 立方格子 a=b=c = =90o 三方格子 a=b=c = 90o， 60， 109o2816 菱面体格子中
9、为特殊角度时，演变成的三种立方体格子 四方格子 a=b c = =90o 六方格子 a=bc =90o =120o 正交格子 a b c = =90o 单斜格子 a b c = =90o 90o 三斜格子 a b c 90o 按结点位置，可有 四种 不同的类型： P 原始格子 （ 角顶 ） C 底心格子 （ 角顶、顶底面 ） I 体心格子 （ 角顶、体心 ） F 面心格子 （ 角顶、每个面 ） P 原始格子 （ 角顶 ） C 底心格子 （ 角顶、顶底面 ） I 体心格子 （ 角顶、体心 ） F 面心格子 （ 角顶、每个面 ） 结构中代表各类等同点的结点在空间的排列方式来说， 格子的种类有、且只
10、有十四种。 衍射方向 二、 X射线晶体结构测定基本过程 蛋白质获取（提纯） 晶体生长并经冷冻技术处理 重原子衍生物制备 衍射数据收集 衍生数据分析和改进 结构模型的获取（包括修正） （ 2）晶体生长过程及影响因素 晶核（尽量少） 微晶（可用作晶种） 晶体在数小时至数月后出现 2个问题： 是盐晶吗？ 能给出有用的衍射吗？（多晶 /双晶） 影响因素 物理因素 ： 温度、压力、震动、溶剂清洁度、试剂 纯度、重力、外加物理场等 生物化学因素 ： pH、离子强度、沉淀剂 /添加剂的 类型和浓度等 其他 ： 溶液过饱和度、纯度等 “经验” “机器人” （ 2）晶体生长过程及影响因素 （ 3）结晶方法 批量
11、结晶法 batch crystallization 透射法 crystallization by dialysis 液相扩散法 liquid diffusion 气相扩散法 vapor diffusion 氢氘交换质谱技术 Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, DXMS 生物玻璃 bioglass （ 4）晶体的初步鉴定 小分子晶体 蛋白质晶体 边界 完整，漂亮 常不完整，易出现多晶 硬度 偏硬，易碎成 2瓣或几瓣 偏软，易碎成粉 脱水 不变化 因脱水而变坏 溶解性 慢 快 偏光性 强 相对弱 染色性 弱 强
12、漂浮性 下沉 漂浮 （ 5）衍射数据收集 晶体的处理：低温液氮气冷流技术 数据收集仪： 底片、面探测器 衍射分析仪器的发展 射线种类：连续射线 特征射线 电子衍射 中子衍射 探测技术：胶片 闪烁体计数器（点） （ IP） CCD探 测器（面） 图 2-22 石英的衍射仪计数器记录图（部分） *右上角为石英的德拜图，衍射峰上方为（ hkl）值， 代表 K 衍射 底片（外森堡相机、徘循相机） 优点： 多点同时收集 容易保存 价格便宜 缺点 o 存在“化学雾”背景和 X射线散射背景 o 费时、费力 计数管（四圆衍射仪） 将 X射线光子强度转换为电信号，信号放大后 再转换成数字存入计算机随时调用 逐点
13、收集数据 优缺点与底片相反 面探技术 -SMART APEX-CCD衍射仪 Smart CCD Overview SMART APEX-CCD探测器 金属丝构成的面板，可同时多点收集 将 X射线光子强度转换为电信号 集计数管的精确和底片的多点收集效率 面探技术 -SMART APEX-CCD衍射仪 图像板 image plate 面探测器的改进 由化学材料构成，整块板子密度一致 高分辨率 可见光下可测量 集底片和面探测器的优点于一身 （ 6）数据分析 电子密度修饰 电子密度图诠释 结构模型精化 数据处理软件： Denzo, Scalepack 三、 X射线晶体结构测定优点 分辨率高 不损伤样品
14、 无污染 相对快捷 能得到晶体完整性的大量信息 晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态 的构象； 很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构 分析的足够大的单晶； （瓶颈） X射线晶体衍射的工作流程较长。 四、 X射线晶体结构测定存在问题 Last update: Tuesday Oct 20, 2009 at 5 PM PDT 于 1971年和 1972年分别得到分辨率为 2.5埃和 1.8埃的猪胰岛素晶体测定， 这是中国阐明的第一个蛋白质的三维 结构。 猪胰岛素 (蛋白质编号 4ins)的两条小链 “中国蛋白质晶体学研究水平和世界发达国家一样高！ 胰岛素晶体最好的电子密度图在北京，不在牛津
15、。” 多萝西 霍奇金 ， 1972 五、应用实例 1.胰岛素 2.菠菜捕光蛋白 LHC II（膜、疏水， 2.72） Nature, 2004, Mar. LHC-II是绿色植物中含量最丰富的主要捕光复合物 ， 这种复杂的分子体系 镶嵌在生物膜中 ， 具有很强的疏水性 ， 难以分离和结晶 。 对其晶体结构的 测定是国际公认的高难课题 ， 也是一个国家结构生物学研究水平的重要标 志 。 03年利用北京同步辐射实验室生物大分子晶体学线站获得了该晶体的 高分辨率衍射数据 ， 最终获得 2.72分辨率的晶体结构 。 发表于 Nature 2004年 3月 18日作为封面文章 Chang et al., Nature 428, 287 (2004) 意义：发现了膜蛋白 结晶的第三种类型， 提供了近 3万个独立、 精确的原子坐标 复习思考题 1. 简述 X射线晶体结构测定的基本过程。 2. 了解晶体鉴定的基本要点。 3. 熟悉 X射线晶体结构测定的优缺点。 此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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