吸入异氟烷对大鼠肺表面活性蛋白

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1、吸入异氟烷对大鼠肺表面活性蛋白-A（SP-A）的影响李志红1 杨拔贤2 安海燕 2（1 北京肿瘤医院麻醉科，北京，100036；2 北京大学人民医院麻醉科，北京，100044） 摘要目的 观察大鼠吸入不同浓度异氟烷时，肺表面活性蛋白 -A（SP-A）的含量及其基因表达的改变。方法 雄性Wistar大鼠104只随机分为5组：组1，空白对照组 （Con，n=8）；组2，40% O2对照组（40% O2，n=24）；组3，0.7%异 氟烷组（0.7%Iso，n=24）；组4，1.5%异氟烷组（1.5%Iso，n=24）； 组5, 2.0%异氟烷组（2.0%Iso, n=24）。其中组2吸入40% O

2、2,组3、4、 5大鼠分别吸入设定浓度的异氟烷（载气为40%O2）。除空白对照外， 其余各组再分为三个亚组：4小时组（4hr, n=8）、8小时组（8hr，n=8） 和10小时组（10hr，n=8） 4hr和8hr亚组分别吸入各组气体4小时和8 小时，组2中10hr亚组吸入40% O210小时，3、4、5组中10hr亚组分别 吸入设定浓度异氟烷8小时，停药后再吸入40% O2两小时。于设定时 间点迅速处死实验大鼠，取肺组织透射电镜观察肺泡II型上皮细胞结 构变化；检测支气管肺泡灌洗液中SP-A的含量（Western Blot）； II型 上皮细胞中SP-A的含量（IHC）；以及SP-AmRNA

3、的表达（RT-PCR）。结果1. 40%O2组中各亚组的各项指标与Con组均无显著差异。2. 透射电镜观察肺泡II型上皮细胞结构：吸入异氟烷后，0.7%Iso 组肺泡II型上皮细胞形态学无明显改变；1.5%Is o组和2.0%Iso组的肺 泡II型上皮细胞可见明显形态学改变，尤以8hr亚组明显。3支气管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A的含量：0.7%Iso组中4hr 亚组外，各吸入异氟烷组大鼠的BALF中SP-A的含量均较Con组显著 下降(p0.01) ； 1.5%Is o组和2.0%Is o组中8hr亚组较0.7%Is o组8hr亚组下 降更明显(p0.01)。各组内不同亚组间的比较可见：

4、0.7%Iso组中8hr、 10hr亚组较Con组明显下降(p0.01),但两亚组间无明显差另U； 1.5%Iso 组与2.0%Iso组中各亚组均明显低于Con组(p0.01),各亚组间也未 见明显区另。4. 免疫组化检测肺II型上皮细胞中SP-A的含量：1.5%Iso组与 2.0%Iso组肺泡II型上皮细胞中SP-A的含量明显下降，而0.7%Iso组较 Con组无明显变化。5. 肺组织匀浆中的SP-AmRNA含量：吸入异氟烷的各组中， 0.7%Iso组SP-AmRNA的含量与Con组、40%O2组均无明显差异； 1.5%Iso与2.0%Iso组中4hr、8hr亚组SP-AmRNA的表达均明显

5、低于Con 组、40%O2组和0.7%Iso组中相应的亚组，有统计学差异(p0.01)， 各组的10hr亚组均恢复至Con组水平。结论 吸入1.5%或更高浓度的异氟烷4小时以上，可降低大鼠肺 组织SP-A的基因表达和蛋白合成，并可能影响其分泌和再摄取。停 止吸入异氟烷2小时后，大鼠肺组织SP-A的基因表达可恢复至正常水 平，但蛋白合成需更长时间才能恢复。关键词异氟烷；肺表面活性蛋白-A (SP-A)；基因表达异氟烷(isoflurane. Iso)由于具有安全、低毒和可控性好等优 点，而成为目前临床最常用的吸入麻醉药。但是，其对呼吸系统，尤 其是对肺泡上皮细胞的不良影响也已为人们所重视。有动物

6、实验表 明，异氟烷可以降低肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)的合成 (包括磷脂和蛋白)，增加肺部的炎性反应并降低肺部的防御机制， 1-5 是引起术后肺部并发症(如肺不张、肺部感染等)的影响因素之 一。而肺表面活性蛋白-A (surfactant protein A, SP-A)是肺表面活性 物质中含量最多，与PS的合成和分泌密切相关的一种蛋白质，并对 PS 的生理功能和肺自我防御机制起到重要作用6-7。有研究表明，大 鼠吸入较高浓度异氟烷时，支气管肺泡灌洗液中的SP-A浓度下降。 异氟烷还可使培养的正常II型肺泡上皮细胞内和培养液中SP-A的含 量降低。5 然而

7、，吸入异氟烷引起上述改变发生在哪一水平，目前 还未见明确报道。因此，本实验研究拟通过检测吸入不同浓度异氟烷 大鼠的支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid, BALF)和肺组 织中SP-A的含量，以及肺组织中SP-AmRNA含量的变化，来探讨 异氟烷对肺内SP-A的合成、分泌与基因表达的影响。材料与方法(一)实验动物:健康成年Wistar大鼠104只，体重20010g，由中国人民解放军 军事医学科学院实验动物中心提供，于北京大学人民医院实验动物中 心(SPF级)预检7-10天，六只一笼饲养，动物室和实验室温度为23oC，12h 明暗轮流光照，自由饮食。（二）

8、试剂与药品:异氟烷（美国雅培制药有限公司） 戊巴比妥钠（德国默克制药公司）40% Acrylamide （丙烯酰胺:N, N双丙烯酰胺 =29:1,美国Bio-Rad 公司）；N, N, N, N四甲基乙二胺（TEMED，美国Promega公司）; 标准分子量蛋白（Protein Molecular Markers,美国Biolab公司）; 标准浓度蛋白（美国 Promega 公司）；蛋白分析液（美国 Bio-Rad 公司）；Tween-20 （美国 Bio-Rad 公司）；苯甲磺酰氟（PMSF，美国Sigma公司）；正钒酸钠（Sodium Orthovanadate, NaVO4，美国 Si

9、gma 公司）； 抑肽酶（Aprotinin,美国Sigma公司）；ECL化学发光试剂盒（英国Amersham公司）；兔抗SP-A多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，工作浓度1:200） 辣根过氧化物酶结合羊抗兔多克隆抗体（美国Santa Cruz公司, 工作浓度 1:2000）；LSAB试剂盒（丹麦Dako公司）；RNA提取试剂（Trizol,美国Promega公司）；TBE 5X（上海生工生物工程技术服务有限公司）；Oligo（dT）15、M-MLV 逆转录酶（美国 Promega 公司）；Rnasin （日本 Toyobo 公司）；焦磷酸二乙酯（DEPC，美国Sigma公司）；2

10、X Taq PCR MasterMix （包含 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgC 浓度为2X）（北京天为时代公司）；核酸分子量参照物：DNA markerII （北京天为时代生物科技有 限公司）；琼脂糖（购自北京鼎国生物有限公司）；（三）主要仪器:Narcomed 2B 麻醉机 （Drager公司）机玻璃麻醉箱（40cmX 30cmX 30cm）（北京有机玻璃厂）气体监测仪（Datex-Ohmeda，芬兰）低温高速离心机（Sigma公司、Eeppendoff公司）恒温水浴锅（哈尔滨东方电控开关厂）VM-1000 型涡旋振荡器（Upwards Biosystems 公司）10kD离心超

11、滤管（美国Millipore公司）Mini II PROTEAN稳压稳流型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；石墨转移电泳仪（北京科普仪器厂）；紫外/可见分光光度计（日本SHIMADZU公司）；-80C低温冰箱（日本SANYO公司）；TN型托盘式扭力天平（上海第天平仪器厂）；AEU-20电子天平（德国Siemens公司）；300C烤箱（天津市实验仪器厂）；DT-100光电天平（北京光学仪器厂）；台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）；Hybond PVDF 膜（美国 Amersham 公司）MOS-1 水平摇床（北京 Beide 公司）；X 光胶片（美国 Kodak 公司）；组织切片机（德国Lei

12、tz公司）；双目显微镜（日本 Olympus 公司）；PCR 仪（德国 Eppendorf 公司）（四）实验方法:1实验动物分组：雄性Wister大鼠104只随机分为5组：组1,空 白对照组（Con, n=8）；组2, 40% O2对照组（40%O2，n=24）；组3, 0.7%异氟烷组（0.7%Iso, n=24）；组4, 1.5%异氟烷组（1.5%Iso, n=24）； 组5, 2.0%异氟烷组（2.0%Iso, n=24）。除空白对照外，其余各组再 分为三个亚组：4小时组（4hr, n=8）、8小时组（8hr, n=8）和10小 时组（10hr, n=8）。4hr和8hr亚组分别吸入各组

13、气体4小时和8小时， 组2中10hr亚组吸入40% O210小时，3、4、5组中10hr亚组分别吸入设 定浓度异氟烷8小时，停药后再吸入40% O2两小时。2. 检测指标和方法2.1肺组织的取材和固定实验结束后取出试验大鼠，麻醉（1g/L戊巴比妥钠, 40mg/kg , ）后,采用1 4号套管针外套管行气管插管, 放血活杀。从每只大鼠右上肺叶切取约2 mm3肺组织，3%戊二醛固 定。超薄切片,透射电镜观察。其余右上肺叶, 4%甲醛固定,石蜡 包埋、切片。另外3叶右肺组织-70C冻存备用。2.2检测BALF中SP-A的浓度(Western Blotting) 按照参考文献Rio 的方法收集肺泡灌

14、洗液。大鼠放血活杀后，于肺门处结扎右主支气管， 自气管插管缓慢向左侧肺内注入生理盐水(4C预冷)12ml/kg,注毕， 使液体在肺内停留 3o 秒，然后放平注射器，抬高大鼠下半身，借重 力收集肺泡内灌洗液体，重复 3 次。将 3 次所得灌洗液收集汇总，记 录总量，计算灌洗回收率，总回收率为80%左右。将BALF于4C、 1ooorpm 离心 1 omin ，去除细胞和杂质。上清液经超滤(超滤管 Millipore, USA)浓缩约1015倍。Follin酚法测定蛋白浓度，加入 上样缓冲液，配制样品的终浓度为1p g/p l,按每泳道40p l样品上 样，10%聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳(B

15、iorad，USA)o Western Bloting 法对SP-A进行免疫印记分析，一抗为兔抗SP-A多克隆抗体(Santa Cruz，USA)，辣根过氧化物酶标记二抗，化学发光(二抗与发光液, Santa Cruz，USA)，曝光X光片，将X光片上的条带数字化，并进 行统计分析。2.3检测肺泡II型上皮细胞中的SP-A含量(immunohistochemistry， IHC)取右上肺组织石蜡切片，经脱蜡、H2O2封闭。采用兔抗SP-A多克隆抗体(Santa Cruz，USA) 4C过夜。二抗及显色系统应用免疫 组化试剂盒(中杉公司)，DAB显色后于光镜下观察，结果以胞浆内 可见棕红色颗粒者

16、为阳性，并按下列标准判断：(-)为不着色或呈背景 颜色；(+)为弱阳性，细小显色颗粒，数量稀少；(+)为强阳性，粗 大显色颗粒，数多密集；(+)为表现介于(+)和(+)之间。112.4肺组织内SP-AmRNA含量（RT-PCR）取-70C冻存的肺组织50 “g,总RNA提取用酸酚一步法（试剂为Trizol , Invitrogen, USA）。 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）（逆转录酶M-MLV, Promega, USA； Taq 酶 2Xbuffer, Tiangen,北京）方法测定 SP-AmRNA 相对 含量。GAPDH作为内参照。PCR产物经2%琼脂糖凝胶（含EB）电 泳,于

17、紫外灯下可见清晰条带,扫描并行图象和分析。引物序列12-14： SP-A 上游 5-atg tca ctg tgt tct ttg gcc ttc-3 下游 5-tca aaa ttc aca aac agc cag cc-3； GAPDH 上游 5-ggg cag ccc aga aca tea tcc-3下游 5-cca gcc cca gca tca aag gtg-3。SP-A、GAPDH 扩增产物为 747bp、 298bp。（五）统计方法:实验数据以SPSS13.0软件包处理，以均数土标准差（Xs ）表示。 计量资料采用单因素方差分析和LSD法两两比较，P0.05为差异有 统计学意

18、义。结果1. 40%0组中各亚组的各项指标与Con组均无显著差异。22. 形态学观察（表 1）：对照组可见正常肺泡结构正常,电镜下 见肺泡II型上皮细胞附于肺泡壁，细胞器清晰，肺泡腔侧见大量板层 体,板层体出胞现象多见。 0.7%Iso 组在光镜和电镜下均与对照组差 异不大，但板层体出胞现象较少见。1.5%Iso组与2.0%Iso组的多数 切片在光镜下与对照组差异不显著,但少数切片可见肺泡隔增宽、炎 性细胞浸润以及肺泡腔中渗出增加等病理现象；而在电镜下可见肺泡II型上皮细胞变形、脱落，细胞器肿胀模糊，板层体排空或空泡样变3. 大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中SP-A含量（表2）：氧气对照组（

19、40%0组）中各亚组BALF中SP-A含量均与空白对照无差异。吸入异2氟烷各组除0.7%Iso-4hr亚组外，BALF中SP-A的含量均较空白对照组 和同时点氧气对照组（40%0组中各亚组）有显著下降（p0.01）；21.5%Iso 组和 2.0%Is o 组的 8hr、10hr 亚组与 0.7%Is o 组的 8hr、10hr 亚 组分别相比，BALF中SP-A的下降更为明显，组间比较有显著性差异（p0.01）。4. 免疫组化检测肺组织中SP-A表达的变化（表3）： Con组大鼠 肺组织内SP-A表达丰富，分布于肺泡II型细胞、支气管上皮细胞及部 分肺泡巨噬细胞内，呈棕黄红颗粒，肺泡及细支气

20、管腔内也有一薄层 棕红色物质。40%02组与Con组和0.7%Iso组中各亚组均与对照组无明 显差异；1.5%Iso组、2.0%Iso组8hr亚组大鼠肺泡II型细胞内的SP-A 表达比对照组明显减弱。按前述判断标准进行评定，结果见表5。5. 大鼠肺组织SP-AmRNA表达（表4）: SP-AmRNA的表达以SP-AmRNA 与GAPDHmRNA表达量的比值表示。与空白对照组相比，40%O组和20.7%Iso组的表达量无明显差异；1.5%Iso组和2.0%Iso组4hr、8hr大 鼠肺组织SP-AmRNA均较同时点40%0对照显著下降（P0.01），但10hr2亚组可以恢复到空白对照水平。讨论肺

21、表面活性蛋白（surfactant protein, SP）是肺表面活性物质 的重要组成成分，其含量约占肺表面活性物质总量的10%。根据其分 子结构，可分为亲水性的SP-A、SP-D和疏水性的SP-B、SP-C。其中 SP-A 是肺表面活性物质中含量最多的一种的糖蛋白，分子量为 28-36kD15, 16,17,主要存在于肺泡II型上皮细胞内和肺泡膜表面。目 前已发现SP-A的生理作用包括三方面：参与磷脂的表面活性功能: 结合磷脂，尤其是DPPC；促进板层体(Lamellar Body, LB)转化为 管髓体(TM)；促进磷脂单分子层的形成并维持其稳定；限制血浆蛋 白进入肺泡腔等。X维持PS的

22、动态平衡：调节LB的分泌；增强 肺泡II型上皮细胞对脂质的摄取等18。免疫及免疫调节作用：粘附、 结合并灭活多种病原微生物；直接抑菌作用；抵抗变应原及抑制肺部 超敏反应；抗原呈递及调理 T 细胞和巨噬细胞，提高巨噬细胞的趋化 性；调控肺部炎症反应；抑制脂质过氧化等。19 由于 SP-A 具有上述 重要生理功能，因此， SP-A 质和量的改变与许多肺部疾病的发病密 切相关，例如，在急性肺损伤(ALI)、ARDS、COPD及哮喘时，SP-A的 含量均明显降低。而 SP-A 基因敲除小鼠则会因为严重肺部感染和剧 烈的炎症反应而死亡。a因此，SP-A作为肺损伤的指标已日益受到 重视，最近还有人提出将B

23、ALF和血清中SP-A的含量，用作预测ARDS 等重症患者预后的指标之一。 21我们研究的结果显示：吸入40%0 10小时未影响大鼠BALF、2肺组织中SP-A的含量，也未改变肺组织中SP-A的基因表达。既往的 研究显示，长时间吸入纯氧可以降低肺表面活性物质的合成， 22但通 常认为长时间吸入40%O没有明显影响。本实验结果显示，吸入40%O2210小时未改变大鼠肺SP-A的表达。短时间（4小时）吸入异氟烷, 浓度为0.7%时，大鼠BALF中的SP-A含量较同时点40%O对照组无明2显改变；但吸入浓度为1.5%或2.0%时，BALF中的SP-A含量明显降 低。长时间（8 小时）吸入异氟烷浓度为

24、 0.7%、1.5%或 2.0%时，均 可使大鼠BALF中的SP-A含量明显下降，1.5%Iso组和2.0%Iso组与 0.7%Iso组相比下降更为明显。停止吸入异氟烷2小时后，三组大鼠 BALF 中的 SP-A 含量均未恢复。可见，短时间、吸入低浓度的异氟烷 则不会造成肺泡腔中的SP-A的含量下降，但长时间吸入高浓度异氟 烷会使之降低，并且在停药后2小时内无法恢复。肺组织内的SP-A 含量则显示出更明显的异氟烷的浓度依赖性。吸入异氟烷浓度为1.5% 或2.0%时，肺组织内的SP-A含量明显下降，4hr亚组和8hr亚组间 无明显差别，停药后2小时可部分恢复，但未恢复至正常水平。吸入 0.7%异

25、氟烷时，仅8hr亚组肺组织SP-A水平轻微下降（与空白对照 的差异有显著性，但与 4hr 亚组的差异无显著性），并在停药 2 小时 内完全恢复。免疫组织化学染色结果显示肺泡II型上皮细胞内SP-A 含量的变化趋势与一致。肺组织中SP-AmRNA的含量也呈现与吸 入异氟烷浓度相关的下降趋势。 0.7%Iso 组 4hr、8hr 亚组虽与对照 组之间无明显差异，但出现下降趋势；1.5%Iso组和2.0%Iso组较对 照组下降明显，组内4hr、8hr亚组间无明显差别。各组的10hr亚组 中肺组织SP-AmRNA含量均恢复至与正常对照无显著差异。可见，在本研究中 SP-AmRNA 含量、组织中 SP-

26、A 含量和 BALF 中 的 SP-A 含量均呈现出明显的随吸入异氟烷浓度增高而降低的趋势，基本可以反映 SP-A 的基因表达、蛋白合成以及分泌到肺泡腔中的SP-A的含量的变化趋势。但各项指标的变化并不平行,ALF中的SP-A 含量改变似乎对异氟烷最敏感,0.7%Iso组8hr亚组即可见明显下降, 而此条件下细胞内 SP-A、SP-AmRNA 含量并未出现明显变化。这种不 平行变化的原因可能与SP-A的合成、分泌过程的各个环节有关OSP-A 主要由肺泡II型上皮细胞合成。SP-A基因在核内转录形成的mRNA在 核周和胞浆完成翻译。翻译产物（SP-A前体）在内质网进行剪切和 修饰后，部分进入Go

27、lgi复合体继续加工并移入板层体（LB）,与表面 活性物质中的磷脂成分以及被II型细胞内吞并重复利用的表面活性 物质结合后23,24,以板层体出胞的形式分泌到肺泡腔中。这种分泌方 式因受到神经内分泌及旁分泌等多种因素的调控,称调控分泌。而另 一部分未进入LB的SP-A则直接由胞浆分泌出胞，称持续分泌。持续 分泌较少受到此类因素干扰。站25电镜下0.7% Iso组肺泡II型上皮 细胞的形态结构、细胞器和 LM 的数量与对照组均无明显差别,唯有 LM出胞现象较少见。这也可视为II型细胞调控分泌减少的证据之一。 故此我们推论，吸入低浓度异氟烷（0.7%Iso组）时，大鼠肺泡II型 上皮细胞内SP-A

28、的合成无明显变化，而BALF中SP-A明显下降的主 要原因是由于II型上皮细胞对SP-A的分泌减少所致。在中（1.5%）、 高（2.0%）浓度异氟烷组BALF与细胞内SP-A含量以及组织中SP-AmRNA 的表达均可见明显下降。电镜研究也显示， 1.5% Iso、 2.0% Iso 组 大鼠肺泡II型细胞内板层体明显减少、排空或空泡样变性，甚至部分 肺泡II型细胞肿胀、脱落，细胞器模糊不清。因此，长时间吸入中、 高浓度异氟烷时，sp-a的合成下降，与既往的细胞学研究结论一致。5，8 并且这一影响至少发生在基因转录的水平，致使作为转录产物的SP-AmRNA含量下降，继而使sp-a的合成降低。同时

29、，本研究还发现同一浓度组的不同亚组间，虽然各项指标在 不同时间点的反应不尽相同，但时间依赖性并不明显。吸入中（1.5%）、 高（2.0%）浓度异氟烷时，无论短时间（4 小时）还是长时间（8 小 时）sp-a的基因表达水平、蛋白合成和分泌均下降，且亚组间比较 无显著差异。吸入低浓度（0.7%）异氟烷时，短时间（4 小时）内各 项指标均无明显变化，而长时间（8小时）则可见sp-a的合成和分 泌有下降趋势，但本实验仅观察到一个时间点的变化，尚无法判断其 是否会随吸入异氟烷的时间增加而继续下降。因此，我们认为吸入中（1.5%）、高（2.0%）浓度异氟烷8小时以内，异氟烷对SP-A的基因 表达及蛋白合成

30、的抑制作用并不会随时间延长而加重。从而推测异氟 烷可能使肺泡II型上皮细胞中SP-A的基因表达与蛋白合成下调到某 一水平，并在一定时间内保持稳定，而非不可逆性的破坏作用。停止吸入异氟烷后， SP-A 的基因表达最先恢复，蛋白合成水平 在停药2小时后部分恢复，而肺泡腔中的SP-A水平则在停药2小时 后仍未见恢复。可见，SP-AmRNA水平是判断SP-A表达水平最敏感、 反应最快的指标。因此，我们推测吸入中（ 1 . 5% ） 、高（ 2 . 0% ）浓度 的异氟烷对大鼠肺内SP-A的影响是发生在肺泡II型上皮细胞的基因 转录水平的，由于吸入异氟烷降低了 SP-AmRNA转录，继而使II型细 胞合

31、成SP-A下降。但异氟烷仅是将肺泡II型上皮细胞中SP-A的基因 表达与蛋白合成下调，而非不可逆的损伤，并能在一定时间内保持稳 定。这也可能是在停止吸入异氟烷后，SP-AmRNA含量可以迅速恢复 的原因之一。异氟烷如何调节SP-A的基因表达，目前尚不清楚。因SP-A的表 达调控机制极为复杂，其中涉及多种激素、细胞因子及一系列转录因 子等。它们通过作用于DNA序列中的多个元件，而达到上调或下调基 因表达的作用，其中任何一项的变化都会改变SP-A的基因表达水平。 3，24 吸入异氟烷对肺部的影响已有许多研究，其中加重肺组织的炎 性反应，减少肺表面活性物质的合成，以及DNA损伤、蛋白质氧化、 脂质过

32、氧化等宙，26可能与SP-A的表达下调有关。Kotani等曾发现， 异氟烷等卤代麻醉药能增加来源于肺巨噬细胞的前炎症细胞因子，如 TNF-a的表达。TNF-a可通过转录因子NF-k B介导的调节作用，使 细胞内SP-AmRNA含量减少，并抑制SP-A的合成。m Osanai等通 过对原代培养的肺泡II型上皮细胞的研究发现，分泌到培养介质中的 SP-A主要是新合成的，而聚集在板层体中的SP-A是由肺泡II型上皮 细胞从细胞外摄入的。这一发现与SP-A参与调节磷脂回收和再利用 有关。最近Kim等28报道，大鼠吸入1%的异氟烷60分钟后，淋巴细 胞、骨髓、肺脏、肝脏等组织中DNA损伤和蛋白质氧化增加

33、。但同时 有研究表明， SP-A 具有调节肺炎性反应和抑制脂质过氧化等作用， 即 SP-A 含量及功能的下降有可能加剧肺部炎症反应、磷脂的破坏， 从而使肺损伤更加恶化o 29由此可见，一些能够改变SP-A基因表达 的因素，往往也受到SP-A的调节，呈现出错综复杂、互相调控的关 系。因此要了解异氟烷下调 SP-AmRNA 表达的确切途径，还需进一步 深入研究。综上所述，吸入低浓度（0.7%）的异氟烷对大鼠 SP-A 的基因表 达和蛋白合成影响较小，但长时间（8小时）吸入有可能降低肺泡II 型上皮细胞对SP-A的分泌，而使BALF中的SP-A含量下降。中（1.5%）、 高（2.0%）浓度的异氟烷明

34、显抑制了大鼠SP-A的基因表达、合成和 分泌，致使肺组织中SP-AmRNA、肺泡II型上皮细胞中SP-A以及BALF 中的SP-A含量均明显下降。但这一过程是可逆的，停止吸入异氟烷 2 小时 SP-A 的基因表达可恢复至正常水平，其合成与分泌的恢复需 要更长时间。异氟烷对大鼠肺SP-A的影响发生在基因转录水平，其 确切机制尚需进一步研究。结论1吸入临床相关浓度（1.5%或更高浓度）的异氟烷 4 小时，可 以抑制肺泡II型上皮细胞合成和分泌SP-A。吸入低浓度（0.7%）的 异氟烷对肺泡II型上皮细胞合成SP-A的影响较小，但持续长时间（8 小时），有可能影响其分泌或增加肺泡腔中SP-A的降解。

35、2吸入异氟烷对大鼠肺 SP-A 合成的影响具有一定的浓度依赖 性。本实验中，吸入高浓度异氟烷的大鼠肺内SP-A的基因表达和蛋 白合成明显低于对照组和吸入低浓度异氟烷组。3.吸入中、高浓度异氟烷4-8小时范围内，肺组织中SP-A的基 因表达、蛋白合成及分泌的下降并无明显时间依赖性。因此，吸入 2.0%的异氟烷8小时以内，异氟烷对SP-A的基因表达及蛋白合成的 抑制作用并不会随时间延长而加重。4异氟烷对大鼠肺SP-A的影响是可逆的，在停药2小时内，大 鼠肺内的 SP-A 基因表达均可恢复至正常对照水平，但蛋白合成与分 泌的恢复稍慢。从而推测吸入2.0%以下的异氟烷可使肺泡II型上皮 细胞中 SP-

36、A 的基因表达下调到某一水平，并在一定时间内保持稳定， 而非不可逆性损害。这也可视作停止吸入异氟烷后， SP-AmRNA 含量 可以迅速恢复的原因之一。参考文献1 Gunaydin B ， Karadenizli Y， Babacan A， et al. Pulmonary microvascular injury following general anaesthesia with volatile anaesthetics -halothane and Isoflurane: a comparative clinical and experimental study Respir Med

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51、Am. J. Physiol. 1999,277, L580 L588.组别肺泡II型细胞及细胞器形态胞浆内板层体数量板层体出胞数量Con正常大量多见40%O2 组4hr 亚组正常大量多见8hr 亚组正常大量多见10hr 亚正常大量多见组0.7%Iso 组4hr 亚组正常大量较少见8hr 亚组正常大量较少见10hr 亚正常大量，甚至多于对照较少见组1.5%Iso 组4hr 亚组大致正常，不如对照组清晰、数量下降少见饱满8hr 亚组细胞内出现空泡，数量明显下降，未见细胞器减少部分呈空泡状10hr 亚有所恢复，但仍不如有所恢复，板层体较未见组对照组清晰、饱满8hr 组增多2.0%Iso 组4hr

52、亚组胞浆浑浊，细胞器减少少量未见8hr 亚组细胞脱落、变形胞浆浑浊，罕见，部分呈空泡状未见细胞器减少10hr 亚有所恢复，细胞器仍少少量未见组别空白对照（0时点）亚组4hr8hr10hrCon4413795097240%O242221361372440857 37950456496571360.7%Iso41799237671350790 35326*#38119726790*#1.5%Iso21702734157壮 #236055 35600壮 #203339 25240* #2.0%Iso23012035157*a #22113234137*a #21016631703*a #与同时点40

53、%02对照组相比，*P 0.01；与同时点0.7%Iso组相比，AP 0.01；与0时点空白对照组（Con）比# P 0.01组别亚组nSP-A免疫组化染色强度+Con88（100%）40%O24hr86（75.0%）2（25.0%）8hr87（87.5%）1（12.5%）10hr87（87.5%）1（12.5%）0.7%Iso4hr87（87.5%）1（12.5%）8hr88（100%）10hr88（100%）1.5%Iso4hr85（62.5%）2（25.0%）1（12.5%）8hr85（62.5%）3（37.5%）10hr85（62.5%）3（37.5%）2.0%Iso4hr84（50.

54、0%）4（50.0%）8hr83（37.5%）4（50.0%）1（12.5%）10hr82（25.0%）4（50.0%）2（25.0%）表 6 大鼠肺组织 SP-AmRNA 表达组别空白对照（0时点）亚组4hr8hr10hrCon1.45380.220440%O21.44880.14311.47020.18591.38390.13640.7%Iso1.34400.13061.40180.10631.34470.13511.5%Iso1.21730.1764* #1.19080.1243*aa #1.3805 0.25862.0%Iso1.21200.0866* #1.13310.1175*aa #1.33260.1045与同时点40%02对照组相比，* Pv0.05,*Pv0.01 ；与同时点0.7 % Iso组相比，PvO.05, Pv0.01 ； 与 0 时点对照组（Con）比# Pv0.05, # PvO.01