响应面法优化雨生红球藻产虾青素培养条件

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1、响应面法优化雨生红球藻产虾青素培养条件李嘉仪;窦勇; 邵蓬;高金伟;贾旭颖; 张文慧;王祎哲; 马婷;周文礼期刊名称】天津农学院学报年(卷),期】2019(026)003【总页数】5页(P57-61)关键词】 雨生红球藻;虾青素; 光照强度;响应面作 者】 李嘉仪; 窦勇; 邵蓬; 高金伟; 贾旭颖; 张文慧; 王祎哲; 马婷; 周文礼 作者单位】 天津农学院天津市渔业资源与环境研究室 天津300384 正文语种】 中 文中图分类】 DF413.4雨生红球藻(Haematococcus pluvialis )是一种淡水单细胞藻类。当雨生红球藻 细胞受到外界环境胁迫时，会转变成厚壁孢子状态，其特

2、征主要表现为细胞进入孢 囊期，鞭毛慢慢脱落，运动速度降低直至不游动，色素由核周围逐渐向四周扩散，由绿色最终变为红色1-2。红色酮类胡萝卜素虾青素(3 , 30-二羟基-P，P-胡萝 卜素-4，40-二酮)是最强大的生物抗氧化剂，研究表明，虾青素可能在抗抑郁和预防UVA诱导所致的皮肤老化方面有一定效果3-6。当雨生红球藻细胞处于胁迫 条件下，如营养缺乏，高辐射或高盐浓度时，虾青素以脂肪酰基单酯或二酯的形式 产生7。目前，雨生红球藻是天然虾青素的最佳来源，占细胞干重的4%8-10。 雨生红球藻积累虾青素的关键是胁迫条件，胁迫条件显著影响积累虾青素的含量。 齐安翔等11研究表明，环境因子胁迫条件下，

3、雨生红球藻由绿色营养细胞快速转 变为厚壁孢子，并积累虾青素。才金玲等12认为，高光照强度使雨生红球藻光合 作用和氮类化合物的代谢反应减弱，藻细胞出现胁迫应激，细胞内与虾青素合成的 有关基因被激活，胞内开始合成并积累虾青素。光照胁迫应激下，能使雨生红球藻 中虾青素的合成量增高并保护光合色素，但当光照应激程度超过雨生红球藻抵抗范 围，细胞就会受到损伤而降低虾青素的产量13。盐胁迫是雨生红球藻合成虾青素 常用的技术方法之一，探究适宜的盐浓度范围对雨生红球藻高效合成虾青素有重要 研究意义14。Cordero等15研究表明，2% NaCI是虾青素生产的最佳盐度， 盐度过高会导致雨生红球藻大量死亡。Bou

4、ssiba等16研究表明，光照强度、磷 酸盐和盐胁迫会抑制细胞生长，降低分裂速率，但会积累大量虾青素。有研究认为， 雨生红球藻在缺氮条件下，细胞分离速度降低，会形成厚壁孢子并积累虾青素17。本文以光照强度、NaCl和NaNO3为胁迫条件，优化雨生红球藻虾青素积累的环 境因子组合，旨在为雨生红球藻大规模培养并大量积累虾青素提供基础数据。1 材料与方法1.1 雨生红球藻的培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialis )来源于天津市水产生态及养殖重点实验 室。使用BBM培养基培养11，培养温度设定(221)C,营养细胞阶段光强 设定为2 000-2 200 lx，每天摇动培养瓶数次

5、，防止细胞附壁或下沉。1.2 试验方法1.2.1 雨生红球藻的胁迫处理条件将培养至对数期的雨生红球藻离心(4 000 r/min , 10 min )，得到的藻细胞用不 含有NaNO3和NaCl的新鲜BBM培养基冲洗两次，将得到的不含NaNO3和 NaCl的雨生红球藻细胞密度调整到5x104 cell/mL,进行胁迫试验。通过前期试 验培养确定NaNO3浓度为0、0.13和0.25 g/L ; NaCl浓度为0、2.5和5.0 g/L ; 光照强度为5 000、7 000和9 000 lx，以光照强度（A）、NaNO3浓度（B）和 NaCI浓度（C）等因素作为考察对象，以虾青素含量（Y ）为响

6、应值，采用 Design Expert 8.0统计分析软件的响应面分析法优化试验，共有17个试验点（中心点重复5次，用于估计试验误差） ，以获取最优胁迫条件参数。1.2.2 虾青素含量的测定取出5 mL藻液进行离心，弃去上清液，加入5 mL超纯水清洗，重复两次。然后 用5 % KOH + 30%甲醇破坏叶绿素5 min，弃去上清液后加5 mL超纯水清洗两 次。弃去上清液，收集到藻体中，加入2 mL丙酮，用细胞破碎仪处理10 min , 4 C离心15 min （ 10 000 r/min ），保留上清液，重复以上操作，直至藻团呈白 色，色素提取完全为止。虾青素含量采用公式18:Astaxant

7、hin （ mg /L）=4.6xA480astx稀释倍数1.3 数据处理使用 SPSS 17.0统计软件对虾青素含量所有数据进行单因素方差分析，采用Duncans 多重比较检验均值的差异显著性，差异显著性水平为0.05。利用 EXCEL 2007进行绘图。试验设计使用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken方法的响应面试验设计， 并对数据进行相关线性拟合，通过拟合后线性关系制作预测结果等高线和响应曲面 图。2 结果与分析2.1 响应面分析选用Box-Behnken响应面试验方法19-23，将光照强度、NaNO3浓度和NaCI 浓度进行响应面设计，Box-Behnken

8、响应面设计试验的因素和水平见表1,设计 3 因素 3 水平试验总共 17 组 Box-Behnken 响应面分组，得到虾青素含量见表 2， 将所得表2中数据通过Design-Expert软件拟合方程24-25，拟合得到回归方程 如下:表1 Box-Behnken响应面设计试验的因素和水平编码因素水平光照/lxNaNO3/gL-1 NaCl/gL-1-1 5 000 0 0 0 7 000 0.13 2.5 1 9 000 0.25 5.0 表2试验方案设计及响应值结果因素试验号A:光照B:NaNO3 C:NaCl lx gL-1 gL-1 虾青素含量/mgL-1 1 -1 -1 0 3.8 2

9、 1 -1 0 6.8 3 -1 1 0 4.0 4 1 1 0 5.6 5 - 1 0 -1 4.6 6 1 0 -1 6.2 7 -1 0 1 2.0 8 1 0 1 2.9 9 0 -1 -1 4.2 10 0 1 -1 4.4 11 0 -1 1 3.4 12 0 1 1 3.5 13 0 0 0 5.0 14 0 0 0 4.8 15 0 0 0 4.8 16 0 0 0 5.0 17 0 0 0 4.92.2 响应面分析结果对回归方程Y进行方差分析，结果见表3，该拟合模型有显著性(P v 0.05 )，由 系数显著性检验结果可知，方程A-A(Pv0.01 )和C-C(Pv0.01)

10、对雨生红球 藻积累虾青素含量的线性效应极显著，而B-B则不显著(P 0.05 )。3种胁迫对 雨生红球藻积累虾青素含量影响效果为CAB。二次项中C2(Pv 0.05 )有显 著影响。模型中A、C因素均对虾青素含量有显著影响，交互项A和B、A和C、 B和C均有影响，但不显著(P 0.05 )，因此，可认为3种胁迫方式对虾青素产 生交互式影响较小。F值为5.15意味着该模型具有重要意义，仅2.09%的可能性 是由于失拟概率产生的“模型F值”。说明该拟合符合实际，该模型能较准确反 映光照强度、NaNO3浓度和NaCl浓度对雨生红球藻胁迫高产虾青素的效果。 表3拟合曲线模型方差分析结果方差来源平方和自

11、由度均方F值P值Model 19.37 9 2.15 5.15 0.020 9 A-A 6.29 1 6.29 15.05 0.006 1 B-B 0.06 1 0.06 0.15 0.713 7 C-C 7.41 1 7.41 17.74 0.004 0 AB 0.49 1 0.49 1.17 0.314 6 AC 0.13 1 0.13 0.32 0.588 2 BC 6.34 1 6.34 15.22 0.942 4 A2 0.05 1 0.05 0.12 0.736 3B2 23.99 1 23.99 0.02 0.888 4 C2 4.98 1 4.98 11.91 0.010 7

12、Residual 2.92 70.42 Lack of Fit 2.88 3 0.96 99.83 0.000 3 Pure Error 0.04 4 26.15 Cor Total 22.29 16拟合曲线方差分析结果中相关系数见表4，其中决定系数R2二0.868 9，校正系 数RAdj二0.700 2，通过换算不到0.03%变异模型不能由此模型解释，表明该模 型与实际拟合相符。当Adeq测量精度大于4时是可用的，该模型中Adeq测量 精度为8.316 ，表明该模型可以用于设计并预测胁迫条件对雨生红球藻高产虾青素 的结果。表4拟合曲线模型方差分析结果Std.Dev.Mean%PRESSRSq

13、uared C.V.Adj R- Squared Pred R-Squared Adeq Precision 0.65 4.4614.5046.22 0.868 9 0.700 2 -1.073 3 8.316从上述方差结果可以得到，通过模型可以较好地拟合3种不同胁迫条件对雨生红球藻高产虾青素的效果，为了更加体现研究具体数值较优胁迫效果，使用Design- Expert 软件对3种不同胁迫条件对雨生红球藻高产虾青素含量进行等高线以及响 应面图制作并进行分析。响应曲面图和等高线图可以直观表示试验因素的 3 个水平间与响应值的函数关系， 获取试验设计中最优工艺参数。从图1中可以看出，当NaCI浓度

14、为2.5 g/L时， 光照强度和氮浓度交互作用对雨生红球藻积累虾青素含量的影响。这两个因素交互 作用不显著，随着光照强度和NaNO3浓度降低，虾青素含量缓慢提高，当光照 强度达到9 000 lx和NaNO3为0 g/L条件下，相互交互效果最佳。图1因素A和B交互作用的等高线和响应面NaNO3浓度为0.13 g/L时，光照强度和NaCI浓度交互作用对雨生红球藻积累 虾青素含量的影响，这两个因素交互作用显著，从图2中可以看出，NaCI浓度在 1.25 2.50 g/L时胁迫效果最佳，盐浓度越高积累虾青素效果越差。图2因素A和C交互作用的等高线和响应面光照强度为7 000 lx时，NaCl和NaNO

15、3交互作用对雨生红球藻积累虾青素含量 的影响，两因素交互作用不显著，NaCl浓度为2.5 g/L、NaNO3为0.13 g/L时， 积累虾青素含量最高为5.0 mg/L （图3）。图3因素B和C交互作用的等高线和响应面3 讨论 由于雨生红球藻中虾青素在胁迫条件下积累明显，因而绝大多数采用胁迫条件处理 方法，但不同胁迫条件和胁迫程度对积累虾青素效果会有较大差别。研究雨生红球 藻实现高产虾青素一直是本行业的重要课题。本研究通过利用RSM （响应面法） 允许响应面的可视化表示作为定位最大点的直接手段，并且通过适当计算机程序的 可用性，数学操作被简化为常规程序，筛选积累虾青素的条件来进一步实现高产虾

16、青素这一目的。这种统计方法可以很容易地应用于大多数微藻及其产品，这为RSM应用于任何藻类发酵过程开辟了道路，以优化关键参数并实现最大的藻类生 长13。Niizawa等研究雨生红球藻在氮饥饿条件下，光照强度达到110 pmol/ （m2s ）时，虾青素浓度增加至干生物量的2.7 %，并在应激阶段有效利用光能 26-27。虾青素是藻类细胞中的主要叶黄素，这些叶黄素在培养条件下作为藻类 细胞中的脂肪酸酯存在。光照水平对虾青素积累率有重要影响。Saeki等还发现加 入NaCl促进这些游离和酯型叶黄素的合成，较高的光和盐胁迫协同激活藻细胞中 的胡萝卜素生成28。在氮缺乏和高光条件下，盐的补充会增强培养物

17、中酯化的虾 青素、玉米黄质的合成。4 结论光照强度和NaCl对雨生红球藻积累虾青素有极显著影响（P v 0.01）; NaCl浓度 为2.5 g/L、NaNO3为0 g/L、光照为9 000 lx时，雨生红球藻积累虾青素含量 最高，达6.80 mg/L。参考文献：【相关文献】1 于馨恒化学诱导剂对雨生红球藻合成虾青素的影响及其机理研究D天津:天津大学，2015.2 Zhang Z，Wang B，Hu Q，et al.A new paradigm for producing astaxanthin from the unicellular green algar Haematococcus pl

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