分离与纯化复习提纲

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1、一、蛋白质的粗提纯:利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分 开。这些方法的特点是简便，处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率 低。1. 盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4）2SO4 Na2SO4 NaCI,使蛋白质脱去水 化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。原理：盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来 溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的 作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析的操作方法：最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少 量多次地加入

2、，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过 大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与 过滤。2. 等电点沉淀：原理：蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液 pH 变化而变化。在溶液 pH 值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质 有不同的等电点，因此通过调节溶液 pH 到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质 分开，从而除去大量杂蛋白。3. 有机溶剂法：与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解 度显著降低原理：降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减

3、小 溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低 而沉淀。由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水 化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。4. 透析：在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓 缩样品等都要用到透析技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品液称为“保留 液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量 （MwCO） 通常为 10KD 左右。5. 超滤：超过滤即超滤，是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和 溶剂穿

4、过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分 子物质得到了部分的纯化。超滤可广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋 白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。原理：利用压力、抽滤或离心力等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜， 而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。二、蛋白质色谱分离1. 液相色谱法：高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系 统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相 的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。原理：高效液相色谱法按组分在

5、两相间分离机理的不同主要可分为：液固吸附色谱法，液 液分配色谱法，化学键合相色谱法，离子交换色谱法和凝胶色谱法（体积排阻色谱法）。各类 型的分离原理以及应用如下：模式分离原理应用液固吸附色谱利用组分在固定相上的吸附能力不同而分离， 采用非极性或弱极性流动相，保留值取决于官分离几何异构体，不同 族化合物以及用于纯能团的类型和数目化制备液液分配色谱根据物质在两种互不相溶或部分互溶）的液体 中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分 离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大最适合同系物组分的 分离正相键合相色谱利用组分在极性键合固定相与弱极性或非极性 流动相之间分配系数不同而分离，流动相极性 增大，保

6、留值降低分离中等极性化合物反相键合相色谱采用非极性键合固定相和以水为底溶剂的极性 流动相，利用非极性基团的疏水作用和极性基 团在流动相中的二次化学平衡，如形成离子对、 手性包络物、酸碱平衡等进行分离可分离极性较小的样 品，若利用二次化学平 衡，可分离离子、离子 型化合物，包括强酸强 碱离子交换色谱及 离子色谱组分离子与固定相平衡离子进行动态交换，根 据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差 别而达到分离的目的离子、离子型化合物或 者在一定条件下可解 离的化合物凝胶色谱以孔径一定的多孔凝胶为填充剂，样品按照尺 寸差异进行分离。小分子保留值大，大分子保 留值小。根据孔径尺寸范围不同，有定的相 对分

7、子质量分离范围高分子、生物大分子等液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。2. 反相色谱：反相键合色谱法即反相高效液相色谱。 原理：采用非极性键合固定相和以水为底溶剂的极性流动相，利用非极性基团的疏水作用 和极性基团在流动相中的二次化学平衡，如形成离子对、手性包络物、酸碱平衡等进行分 离试验流程：溶解蛋白样品，于4C, 13000rpm离心，取上清液，并用0.45m m孔径滤膜 过滤。 流动相选择去含01%TFA的去离子水和含01%TFA的ACN,进行超声脱气10-20分钟。 打开HPL

8、C工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。进 入 hplc 控制界面主菜单。设置实验方案。 需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀， 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要 超过 2000psi 将进样阀旋至loading，采用进样针进样，注意不要注射进气泡，再旋至inject，点击软件 inject，检测蛋白分离，并收集样品。 清洗层析柱，关机时，先关计算机，再关液相色谱。3 离子交换色谱：原理：组分离子与固定相平衡离子进行动态交换，根据不同组分离子对固定离子基团的亲 和力的差别而达到分离的目的试

9、验过程： （1）层析柱：离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换 用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1： 101： 50之间，层析柱安装 要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。（ 2）装柱：先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定； 将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶23cm为宜；（3）平衡缓冲液 ：平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡 缓冲液的离子强度和 pH 值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使 各个待分

10、离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的 结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不 与离子交换剂结合或结合不稳定。（4）上样：离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和 pH 值，上样量也不宜过大， 一般为柱床体积的 1%-5%（体积分数）为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分 离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。用注射器或 细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样母刚好 全部进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱，洗出未被吸附的物质。（5）洗脱缓冲

11、液：在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变 pH 值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂 结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH值从低到 高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。 由于 pH 值可能对蛋白的稳定性有较大的 影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱（6）洗脱速度：洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。 一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、 谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果

12、洗脱峰 相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果 分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。7）样品的浓缩、脱盐：离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大， 样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。4. 分子筛（凝胶过滤层析）原理： 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形 成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相 的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子 不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能

13、在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动， 它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶 颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；凝胶的种类和性质1）、交联葡聚糖凝胶（Sephadex）Sephadex G 系列G 后的数字为凝胶吸水值的 10 倍。G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。2）、琼脂糖凝胶（ Sepharose； Bio-Gel）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。3）、聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶一P （Bio-Gel

14、P）4） 、 聚丙乙烯凝胶（ Styrogel） 大网孔结构。试验流程：1层析柱的选择：层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。 一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层 析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度 不超过100 cm,为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1： 251： 100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比 较短。2.装柱（凝胶层析柱）： 1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度 也要恒定。2）应调节

15、有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要捧除 床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的 15。5）柱顼接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注人柱内。注意避免产生气泡。6）柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。7）柱内胶面上部保留23cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住 体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。8）调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静力压，不要超过规数值。如 果使用蠕动泵，注意

16、使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者 10。3洗脱液的选择：由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不像其他层析分离方式主要 依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用， 一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除 组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其他层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那 么严格。4. 加样量：关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能 造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各 组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量

17、的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较 大，当然加样量就可以较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大； 一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的 15（质量分数）左右.5. 洗脱速度：洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持 洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取 决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以 与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反 而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗 脱速度，

18、可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是210 ml/h，市售的 凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。三、蛋白质电泳 蛋白质电泳的基本方法是 SDS-PAGESDS-PAGE的基本原理：是各种物质分子量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后，蛋白质 分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子问的电荷 差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所 以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。 实验过程： 1、制备电泳分离胶：根据样品分子量的大小，配制所需浓度的分离胶。 10100 K 分子量

19、的 样品，宜采用T=12%的胶,40200 K分子量的样品宜采用T=75%的胶。本实验釆用T=10% 的 胶，具体配方如下： 分离胶： 1 号液 3 号液 4 号液 蒸馏水 6 号液 5 号液 10mL 7.5mL 0.3 mL 12 mL 18#L 180pL按顺序配制，加完 6 号液后暂时停下来，临用时再加 5 号液，混匀后立即装入制 胶槽， 约 60 min 后就可以凝固。2、制备电泳浓缩胶（T=038%）浓缩胶:1号液2号液4号液 蒸馏水6号液5号液133 mL5 mL 0.1mL 6.1mL 5yL 0.1mL。按顺序配制，加完6号液后暂时停下来，临用时再加5号液， 混匀后立即装入制

20、 胶槽，约 30 min 后就可以凝固。3、制备凝胶板：制备凝胶板前先用无水乙醇擦拭玻璃板内面。 25%琼脂封边，用并用蒸馏 水检验 是否密封完好。密封好后用吸管缓慢加入分离胶，离顶端约 15 cm 时注入蒸馏水。 待界面清晰后，吸去蒸馏水，用吸管吸取配好的浓缩胶冲洗凝固的分离胶面，插入样 品槽 模板，用吸管缓慢注入浓缩胶。待凝固好后，在玻璃板上用记号笔划出点样槽底线，轻轻 拔出样品槽模板。4、样品制备称取脱盐或冻干的蛋白001g，加1mL蒸馏水溶解后，10000rpm离心5min， 吸取上清50U加等体积的样品缓冲液，沸水浴加热3min，取出瞬间离心，上清液备用。5、标准蛋白制备 方法同样品

21、制备，本实验的标准蛋白已经制备好，解冻后直接加样即可。6、加样用加样器分别取已高速离心过的样品液的上清液5、10、15U，依次加到三个样 品槽的底部。用加样器分别取标准蛋白质10、20U依次加到三个样品槽的底部，标准蛋白 泳道的两侧各加10U样品缓冲液作空白对照。并作好记录以免混淆。上好样后缓慢往样品 槽中加入电极缓冲液，注意不要有气泡。7、电泳 连接电泳仪的直流电源，正极连在凝胶板的下端，负极连在凝胶板的上端，即有 样品的一端。电流值恒为10mA。大约经过45 h样品缓冲液中的溴酚蓝指示剂到 达离凝 胶底部0.5 cm处，关闭电源，取下电泳板，并将两片玻璃板分开，将凝胶板小心移入染色 槽中。

22、8、染色、脱色 加染色剂染色过夜。倾去染色液，加脱色剂将背景的蓝色脱尽，中间要更 换数 次脱色固定液，然后将凝胶板制成干板、扫描。四、 电泳电泳（简称EP）：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移的现象。基本原理：在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状, 在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳 动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球

23、蛋白，其优点 是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。 淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一 板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号 之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦， 分辨率低，实验室中已很少使用。 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大 部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率 较高。核酸的染色与检测溴化乙锭(e

24、thidium bromide, EB)：是一种荧光染料， EB 分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 银染定量及定性较妤,银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成 银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。其灵敏度比EB高200倍但银染色后，DNA回收复 杂。蛋白质染色显色方法灵敏度优点缺点20 Ong操作简便，灵敏性差，价格低康，所需上样量大便于后蟻鉴定银染O.lng灵敏性妤，操作复杂，所需样品少不利于后续整定荧光法Ing线性动态范围大仪器及试剂昂贵考染即考马斯亮蓝染色核酸电泳原理：核酸分子中汤磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化

25、状态；核酸分子在 定的电场强度的电场中，它们会向正极方向迁移。电泳迁移率与分子大小、介质粘度成反 比；因此在同一凝胶、同意电场强度下分离出不同分子量大小的或分子量相同却结构不同 的核酸分子。蛋白质电泳原理：各种蛋白质都有其特有的等电点，在高于其等电点PH的缓冲液中，将形 成带负电荷的质点，在电场中向正极泳动，在同一条件下，不同蛋白质带电荷有差异，分 子量大小也不同，所以泳动速度不同，故可分理处不同等电点的蛋白质。蛋白质电泳 样品处理：称取脱盐或冻干的蛋白001g加1mL蒸馏水溶解后，10000rpm离心5min,吸取上清 50U加等体积的样品缓冲液，沸水浴加热3min，取出瞬间离心，上清液备用

26、。核酸电泳样品处理：可参考总RNA提取五、 蛋白质定量1. 双缩脲法(Biuret法)基本原理：双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨 后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡 具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物 都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基 酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点 是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精

27、确的蛋白质测定。2. Folin酚试剂法(Lowry法)原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与铜离子螯合，形成蛋白质铜复合物，此复合物使酚 试剂的还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作 标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操 作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多.3. 紫外吸收法 原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具 有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正 比。此外，蛋白质溶

28、液在 238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质 溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。缺点，此法的特点是 测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些 与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。4. 考马斯亮兰法（Bradford法）原理：考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax）,由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主 要是与蛋白质中的碱性氨基酸

29、（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下 测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。Bradford 法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋 白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光 吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5分钟左右。由于 染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在 1小时内保持稳定， 且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严

30、格 地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、 巯基乙醇、 EDTA 等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋 白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减少这 方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷 基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer 定律进行计算，

31、而只能用标准曲线来 测定未知蛋白质的浓度。5. BCA 法原理：BCA与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA 人工试剂。在碱性条件下， BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将二价铜离子还原为铜离子，一 个铜离子螯合二个 BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度 与蛋白质浓度成正比。1）操作简单，快速2）准确灵敏，试剂稳定性好3）经济实用，除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量4）抗试剂干扰能力比较强六、蛋白质组学常用技术1. 双向凝胶电泳（2-DE）基本原理：先将蛋白质根据其等电点在PH梯度内进行等电聚焦，然后按照他们的相对

32、分子 质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离2. 基质辅助的激光解吸电离技术（ MALDI） 基本原理：基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由 于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使 基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的 离子与多肽和蛋白质的质量有一对应关系。3. 电喷雾质谱技术（ ESI-MS） 基本原理：在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化 成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量 带一个或多个电荷的

33、离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离 子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析 仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以 根据质荷比及电行数算出。4. MALDI 串联两级 TOF 质谱系统（MALDI-TOF/TOF） 基本原理：将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸 收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场 作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量 电荷之比（M/Z）与离子的飞行时

34、间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。例如， 检测DNA样品时，DNA离子按其质量大小先后通过检测器，DNA片段越短，越早到达检测 器。七、蛋白质结构鉴定技术物理方法1. 质谱法：即用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测的方法。 基本原理：质谱法分析蛋白质的原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质 谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（m/z）的蛋白质离子分离开来，经过离 子检测器收集分离的离子，确定离子的m/z值，分析鉴定未知蛋白质2. 核磁共振法:当用频率为兆赫数量级，波长很长（约0610m）,能量很低的电磁波照射 分子时，能使磁性的原子核在外磁场中发

35、生磁能级的共振跃迁，从而产生吸收信号。3. 荧光光谱法:荧光光谱：荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作 用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发 射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中 不同波长的光成分的相对强度。研究蛋白质分子构象的一种有效方法，它能提供激光光谱、发射光谱及荧光强度、量子产率等物理参数，这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况4红外光谱法:利用物质对红外光区的电磁辐射的选择性吸收来进行结构分析及对各种吸收 红外光的化合物的定性和定量分析的方法化学方法1氨基酸分析:

36、测定蛋白质的氨基酸组成首先要通过酸水解破坏蛋白质的肽键。典型酸水解 的条件是：真空条件下，110C，用6M盐酸水解16至72小时。然后水解的混合物（水解 液）进行柱层析，通过柱层析可以将水解液中的每一种氨基酸分离出来并进行定量，这一 过程称为氨基酸分析（ amino acid analysis）。2.序列分析: 用氨基酸分析并不能得到氨基酸 序列信息，因此，用 Edman 反复降解法对氨 基酸进行 部分序列分析，再用 cDNA 推导来完善该序列八、蛋白质测序1 蛋白质的 N 端测序Edman降解法：Edman降解（Edmandegradation）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是 从蛋白质

37、或多肽氨基末端进行分析。2蛋白质的C端测序（1）羧肽酶法：羧肽酶法的原理就是通过检测羧肽酶逐个释放氨基酸的顺序来判断蛋白质的 C 端序列。（2）化学法：化学法指蛋白质或多肽与化学试剂反应后，专一性的裂解并检测C端氨基酸 的方法。主要有（异） 硫氰酸法和过氟酸酐法。1、（异）硫氰酸法的原理：（异）硫氰酸法又称Schlack-Kumpf降解该方法与Edman 降解的原理类似即化学试剂（异）硫氰酸）与蛋白或多肽的a-羧基反应，形成蛋 白质或多肽乙内酰硫脲 ,再用裂解试剂切下 C 端残基,形成氨基酸乙内酰酸脲 ,然 后利用HPLC系统分离分析游离的氨基酸乙内酰酸脲。由于不同氨基酸的乙内酰 酸脲在HPLC上的保留时间不同，因此可以区分各种氨基酸。C端测序仪的原理 即（异） 硫氰酸法。2、过氟酸酐法的原理：C端氨基酸残基的a-羧基与混合酸酐反应后，通过酮- 烯醇转换成氧氮杂环戊酮（恶唑酮），然后利用过氟酸或TFA把这个环从C端 截掉。然后反应依次连续进行。用质谱测定反应产物的分子量，通过相邻分子 量的差值就可以得到其C端序列。DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的a熹基酸的氨基起反应，生成带有 荧光的、稳定的DNS氨基酸