12基因工程的基本操作程序

《12基因工程的基本操作程序》由会员分享，可在线阅读，更多相关《12基因工程的基本操作程序（44页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、从基因文库获得从基因文库获得利用利用PCR技术扩增技术扩增基因文库基因文库:将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导入片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库的不同的基因，称为基因文库(gene library)(gene library)。基因组文库基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。文库叫做基因组文库。部分基因文库部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基基因文库中包含

2、了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。因文库叫做部分基因文库。某生物体内某生物体内全部全部DNA DNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接与运载体连接 导入导入基因组文库基因组文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNAcDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接与运载体连接 导入导入部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）外显子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因原核生物基因真核生物基因真核生物基因内含子外显子真核生物真核生物cDNA

3、文库与的区别基因组文库文库与的区别基因组文库文库类型文库类型cDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少种间的基因交流种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物某种生物部分部分基因基因某种生物某种生物全部全部基因基因可以可以部分基因可以部分基因可以2、利用利用PCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。因。循环循环（重复重复）变性变性退火退火延伸延伸PCR技术的

4、原理：技术的原理：DNA复制复制(体外体外)过程：变性过程：变性 退火退火 延伸延伸（解链为单链）（解链为单链）（冷却）（冷却）（子链合成）（子链合成）条件：条件：引物（引物（2 2种）；种）；模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）。酶）。多次重复多次重复PCRPCR技术与技术与DNADNA体内复制的区别：体内复制的区别：DNADNA复制复制(体内）体内）PCRPCR技术技术引物引物解旋解旋酶酶操作环境操作环境需要需要需要需要常温条件、解旋酶、常温条件、解旋酶、ATP高温条件（高温条件（9095）DNA

5、解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶、聚合酶、耐高温的耐高温的Taq酶酶体内（细胞内）体内（细胞内）体外体外练习有关练习有关PCRPCR技术的说法，不正确的是技术的说法，不正确的是(）A APCRPCR是一项在生物体外复制特定的是一项在生物体外复制特定的DNADNA片段的核片段的核酸合成技术酸合成技术B BPCRPCR技术的原理是技术的原理是DNADNA双链复制双链复制C C利用利用PCRPCR技术获取目的基因的前提是要有一段已技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列知目的基因的核苷酸序列D DPCRPCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNADNA（1 1

6、）催化）催化过程的酶是过程的酶是_ 。（2 2）过程也称为过程也称为DNADNA的变性，此过程在温度高达的变性，此过程在温度高达90959095时才能时才能完成，说明完成，说明DNADNA分子具有分子具有_性。性。（3 3）由图中信息分析可知，催化）由图中信息分析可知，催化过程的酶都是过程的酶都是_，两者在作用特性上的区别是两者在作用特性上的区别是_ 。（4 4）如果）如果RNARNA单链中有碱基单链中有碱基100100个，其中个，其中A A占占25%25%，U U占占15%15%，则通过，则通过该过程合成的一个双链该过程合成的一个双链DNADNA片段中有胞嘧啶片段中有胞嘧啶_个。个。7075

7、RNA单链杂交双链RNA链 DNA链核酸酶H单链DNA双链DNA90955560反转录酶（或逆转录酶）反转录酶（或逆转录酶）练习：练习：19701970年，特明和巴尔的摩证实了年，特明和巴尔的摩证实了RNARNA病毒能依赖病毒能依赖RNARNA合成合成DNADNA的过程，并的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNAcDNA的过程和的过程和PCRPCR扩增过程示意图。请根扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：据图解回答下列问题：稳定稳定DNA聚合酶聚合酶催化催化过程的酶耐高温过程的酶耐高温603.3.通过通过启动子：启动子：+目的基因：目的基因：+终止子

8、：终止子：标记基因：标记基因：+是是 的结合位点，的结合位点，驱动驱动 过程。过程。RNA聚合酶聚合酶转录转录终止终止 过程。过程。转录转录 有目的基因的有目的基因的受体细胞。受体细胞。鉴定和筛选鉴定和筛选编码人类所需的蛋白质编码人类所需的蛋白质,使生物使生物表达相应性状表达相应性状.复制原点：复制原点：启动复制启动复制质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端基因表达载体的组成基因表达载体的组成复制原点复制原点+启动子启

9、动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因1.1.上述表达载体的启动子、目的基因、终止子、标记上述表达载体的启动子、目的基因、终止子、标记基因的化学成分相同吗？基因的化学成分相同吗？都是都是DNA2.2.终止子和终止密码的化学成分是否一致？终止子和终止密码的化学成分是否一致？终止子终止子DNA,终止转录终止转录;终止密码终止密码RNA上，终止翻译上，终止翻译.3.3.图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶内切酶EcoRIEcoRI、BamHIBamHI的酶切位点，的酶切位点，ampampR R为青霉素抗性基因，为青霉素

10、抗性基因，tcttctR R 为四环素抗性基因，为四环素抗性基因，P P启动子，启动子，T T为终止子，为终止子，oriori为复制为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRIEcoRI、BamHIBamHI在内的在内的多种酶的酶切位点。多种酶的酶切位点。据图回答：据图回答：（1 1）将含有目的基因的）将含有目的基因的DNADNA与质粒该表达载体分别与质粒该表达载体分别用用EcoRIEcoRI酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由 两个两个DNADNA片段之间连接形成的产物有片段之间连接形成的产物有 、三种三种

11、。若。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行行 .（2 2）用上述）用上述3 3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含青霉素的培养基中，能生化实验。之后将这些宿主细胞接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ；目的基因运载体连接物目的基因运载体连接物运载体运载体连接物运载体运载体连接物目的基因目的基因连接物目的基因目的基因连接物分离纯化分离纯化目的基因运载体连接物目的基因运载体连接

12、物运载体运载体连接物运载体运载体连接物练习练习.图为某种质粒表达载体简图，小箭头所图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶指分别为限制性内切酶EcoRIEcoRI、BamHIBamHI的酶切位的酶切位点，点，ampampR R为青霉素抗性基因，为青霉素抗性基因，tcttctR R 为四环素抗为四环素抗性基因，性基因，P P启动子，启动子，T T为终止子，为终止子，oriori为复制原为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRIEcoRI、BamHIBamHI在内的多种酶的酶切位点。在内的多种酶的酶切位点。（3 3）目的基因表达时，）目的基因表

13、达时，RNARNA聚合酶识别和结合的位点是聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是，其合成的产物是 。（4 4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是是 。EcoRI和和BamHI启动子启动子mRNA转化转化1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞花的结构示意图123456789花柄花柄花托花托子房子房花萼花萼花瓣花瓣花柱花柱柱头柱头花药花药花丝花丝雄蕊雄蕊雌雌蕊蕊（花冠）（花冠）2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞

14、显微注射技术：显微注射技术：利用微量注射器在利用微量注射器在显微镜下直接把目的基显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。因注入宿主细胞。3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 导入大肠杆菌的方法导入大肠杆菌的方法:首先用首先用Ca2+处理细胞处理细胞，使细胞处使细胞处于一种能吸收周围环境中于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态分子的生理状态感受态细胞感受态细胞。第二步是将第二步是将重组表达载体重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过分子，完成转化

15、过程。程。显微注射技术显微注射技术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植n采用氯化钙来改变其通透性是为了制感受态细胞，原理是，用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。蔡信之微生物学181页，两种理论都是假说，1、局部原生质化，也就是细胞壁上出现孔，2、好像还涉及细胞表面的转化因子（分子量5000-1-0000）的蛋白质的形成和细胞表面受体结合的转运问题。刘祖洞得遗传书下册，174页，用钙离子处理使细

16、胞膜上出现漏隙，DNA容易进入。n目前常用的对原核细胞的转化方法有两类：电穿孔转化法、化学转化法。电穿孔转化法属于物理方法，不需要对细胞进行特殊处理，但由于受到仪器的限制，实验室更常用的是化学转化法。化学转化法是利用低温（0）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态（competence），此时菌体膨胀成球形，细胞壁和膜的通透性增强。重组DNA与Ca2+形成的羟基-磷酸钙复合物黏附于菌体表面，经42短暂的热冲击处理（热休克）后，黏附表面的重组DNA被吸收进入宿主细胞。然后在营养丰富的的培养基上生长1小时左右，细胞形态复原，进入增殖分裂期。体外重组

17、的DNA分子，需按一定的方式导入宿主细胞，通过宿主细胞的复制而使目的基因得到大量的扩增。宿主细胞也称为受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。原核细胞以大肠杆菌为主，真核细胞包括酵母及动物细胞等。重组分子导入适宜的宿主细胞的过程就是转化。在基因克隆技术中，转化(transformation)特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）及转化大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）及转化 细胞壁厚度因细菌不同而异，一般为15-30nm。主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸构成双糖单元，以（1-4）糖苷键连接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有

18、四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层，像胶合板一样，粘合成多层。肽聚糖中的多糖链在各物种中都一样，而横向短肽链却有种间差异。革兰氏阳性菌细胞壁厚约2080nm，有15-50层肽聚糖片层，每层厚1nm，含20-40的磷壁酸（teichoic acid），有的还具有少量蛋白质。革兰氏阴性菌细胞壁厚约10nm，仅2-3层肽聚糖，其他成分较为复杂，由外向内依次为脂多糖、细菌外膜和脂蛋白。此外，外膜与细胞之间还有间隙。肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁的主要成分，凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都有抑菌或杀菌作用。如溶菌酶是N-乙酰胞壁酸酶

19、，青霉素抑制转肽酶的活性，抑制肽桥形成。细菌细胞壁的功能包括：保持细胞外形；抑制机械和渗透损伤（革兰氏阳性菌的细胞壁能耐受20kg/cm2的压力）；介导细胞间相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；协助细胞运动和分裂。脱壁的细胞称为细菌原生质体（bacterial protoplast）或球状体（spheroplast，因脱壁不完全），脱壁后的细菌原生质体，生存和活动能力大大降低。1、检测与鉴定的目的、检测与鉴定的目的 目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性。和表达其遗传特性。2、抗原抗原-抗体杂交抗体杂交DNA分子杂交技术分子杂交技术D

20、NA-RNA分子杂交技术分子杂交技术DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成复制原点复制原点 +目的基因目的基因 +启动子启动子

21、 +终止子终止子 +标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定A.A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B.B.质粒是基因工程中唯一的运载体质粒是基因工程中唯一的运载体 C.C.运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接外源

22、基因连接 D.D.基因控制的性状都能在后代表现出来基因控制的性状都能在后代表现出来3.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得 A.人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因1.1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有

23、共价结合的糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。2.-2.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大

24、肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？寻根问底：寻根问底：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆四环素的培养基上

25、培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取从中提取-珠蛋白。珠蛋白。寻根问底寻根问底（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提取不行吗？提示：提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并构建基因文库是获取

26、目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNA中，中，直接获得，也可以通过反转录，用直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不

27、同，或者想这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。就需要构建基因文库。寻根问底：寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？果这么做，结果会怎样？提示：提示：有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。格来讲不算基因工程。