免疫组化原理和步骤(精)

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1、免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指 带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈 色反应,对相应抗原进行定性、定位、 定量 测定的一项新技术。它把免疫反应 的特异性、组织化学的可见性巧妙地结 合起来, 借助显微镜 (包括荧光显微镜、 电子显微镜 的显像和放大作用,在细 胞、亚细胞水 平检测各种抗原物质 (如蛋 白质、多肽、酶、激素、病原体以及受 体等 。二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、 振荡器、染缸、光学显微镜、纯木 浆卫 生纸、计时器和通风橱等。三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.3

2、4 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 2H 2 0+58.02 g Na 2 HPO 4 12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 12H 2 0:71.632 g in1000 ml dH 2 O。2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸

3、缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸:10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠 檬酸钠:29.41 g加双蒸水至1000 ml。3. 细胞通透液:由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS,再接着加120 ul TritonX-100, 并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2。4. 5%羊血清或封闭血清,用 PBS 稀释。5. 含 0.03%H 2 O 2 的 0.0

4、5%DAB (避光:用 20xDAB (1%, 10 mg/ml 5 ul+0.1 ul 30% H 2 O 2 +95 ul PBS 。6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。7. Xylene、梯度 Ethanol (100%x2、95%、80%、70%、50%、双蒸水、中 性树胶(封裱剂。8. 苏木精染液:四、操作步骤1、脱蜡、水化 1 60 C x20 minXylene 2 xlO minutes ;2 100% absolute ethanol:2 x5 minutes ;3 95% ethanol 2 minutes;4 80% ethanol 2 minutes;5 70% eth

5、anol 2 minutes;6 distilled water:5 min;7 PBS 洗 3 次 x3 min。2、细胞通透、封闭内 源性过氧化物酶8 用封闭通透液浸润切片 30 min （RT 避光 。 配法是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100加热几分钟后，临用前加400 ul 30%H 2 O 2。9 PBS溶液洗3次x3 min。3、抗原修复暴露抗原 决定族10切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0后，在微波炉里高火4 min至沸腾 后,再加热约6 minx4 次,每次间隔补足液体，防止干片。4、封闭非特异性蛋白11 PBS溶液洗3次x3 m

6、in; 12将切片取出，周围水分用滤纸吸干,用组化笔在 组织周围画上圈 ,在圆圈内组织滴入 5%羊血清 （与二抗来源一致后放入湿盒中 , 室温 30（1030 min ;5、一抗孵育13甩去切片上的羊血清 ,用滤纸擦干组织周围残留血清,直接加入已稀释的一 抗（1:250、 500、 1000后,放入湿盒中室温 1小时,然后 4度过夜,从冰箱中取出需 37 C复温45 min。6、二抗孵育14将一抗倒掉并用PBS洗5 minx5次；15用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 C恒温烤箱中30 min （回收。16 用 PBS 洗 5 次 x5 min;7、SP反应17加入SP后放入

7、37度烤箱中30 min。18 用 PBS 洗 5 次 x5 min;8、显色19加入 DAB (快速滴入,观察染色情况, 倒掉染液 , 显色时间控制在约 5 min(310 min,由镜下观察颜色控制时间。0.05%DAB (避光(1:20储备液:5 ul 20xDAB +0.1 ul 30% H 2 O 2 +95 ul PBS。1%DAB 储备液的制:50mgDAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解,-20 C保存。9、复染、脱水、透明、 封片20用PBS 3次x3min后，用双蒸水洗5 min;21加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲 洗,

8、双蒸水洗5 min,再用PBS返蓝5 min。22 脱水:50% ethanol 1-2 min,70% ethanol 1-2 min95% ethanol 1-2 min;95% ethanol 1-2 min;100% absolute ethanol: (1-2 min; 100% absolute ethanol: (1-2 min。 23 透 明:Xylene 1x(1-2min Xylene 2x-21min24 封片:中性树胶。五、注意事项1. 苏木素复染时间需要摸索,尤其阳性染色也在细胞核上。2. DAB显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太 深。3. 抗

9、体孵育时间和抗体浓度需要摸 索。尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。4. 切片脱蜡和水化要充分;加反应 液时要覆盖组织充分;每次加液前甩干 洗涤 液，但又防止干片;用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干 片。5. 片子着色不均匀的原因如下:脱蜡不充分。可以60 C烤20 min，立即放入 新鲜的 xylene1; 水化不全。应经常配制新鲜的梯度 乙醇; 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； 抗体孵育时，切片放倾斜; 抗体孵育后PBS冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切 片倾斜。6. 一抗从4 C拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？一方面，防止切片

10、从4 C直接放入PBS易脱片;另一方面,使抗原抗体结 合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4 C和37 C度时分子运动方式不同 ，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者 ，后者结合更快 ， 但敏感性也提高了并易造成非特异染色。7. 切片染色后背景太深，不易区分特异 性与非特异性着色？抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二 抗 孵育时间、稀释抗体来控制; 一抗用多克隆抗体易出现非特异性 着色 , 建议试用单克隆抗体看看 ; 内源 性过氧化物酶和生物素在肝 脏、肾脏等组织含量很高,需要通过延 长灭活时间和增 加灭活剂浓度来降低背 景染色; 非特异性组分与抗体结合 ,这需要 通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭 时 间和适当增加浓度来加强封闭效果;DAB显色时间过长或浓度过高;PBS冲洗 不充分,残留抗体结果增强着色; 标本染色过程中出现干片,易增强 非特异性着色。 建议您到杭州百替生物的主页上来看 看,有详细的步骤,我们也可以专业代 做免 疫组化实验哦!