《PCR原理技术与应用附教学用ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR原理技术与应用附教学用ppt课件（25页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、PCR原理技术与运用 PCRPolymerase Chain Reaction即即聚合酶链式反响，是指在聚合酶链式反响，是指在DNA聚合酶催化聚合酶催化下，以母链下，以母链DNA为模板，以特定引物为延为模板，以特定引物为延伸起点，经过变性、退火、延伸等步骤，伸起点，经过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板体外复制出与母链模板DNA互补的子链互补的子链DNA的过程。的过程。是一项是一项DNA体外合成放大技术，能快速特体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基。可用于基因分别克隆，序列分析，基因表达调控，因分别克隆，序列分析，基因表达调控，基因多
2、态性研讨等许多方面。基因多态性研讨等许多方面。PCR技术的根本原理技术的根本原理一一.PCR反响成分：反响成分：1.模板模板DNA；2.引物；引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；聚合酶；5.反响缓冲液、反响缓冲液、Mg2 等。等。二二.PCR反响根本步骤：反响根本步骤：1.变性：高温使双链变性：高温使双链DNA解离构成单链解离构成单链94，30s。2.退火：低温下，引物与模板退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合互补区结合55，30s。3.延伸：中温延伸。延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反响链延伸反响707
3、2，3060s1.变性变性(denaturation)：经过加：经过加热使模板热使模板DNA的双链之间的氢键的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。断裂，双链分开而成单链的过程。2.退火退火(annealling)：当温度降：当温度降低时，引物与模板低时，引物与模板DNA中互补区中互补区域结合成杂交分子。域结合成杂交分子。3.延伸延伸(extension)：在：在DNA聚合聚合酶、酶、dNTPs、Mg2 存在下，存在下，DNA聚合酶催化引物按聚合酶催化引物按53方方向延伸，合成出与模板向延伸，合成出与模板DNA链互链互补的补的DNA子链。子链。以上述三个步骤为一个循环，以上述三个步骤为一
4、个循环，每一循环的产物均可作为下一个每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过循环的模板，经过n次循环后，次循环后，目的目的DNA以以2n的方式添加。的方式添加。PCR反响的成分和作用 总体积：普通为25l100 l 一无Mg2+buffer：由纯水、KCl、Tris组成。Tris用于调理反响体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCl可降低退火温度，但不能超越50 mmol/L，否那么会抑制DNA聚合酶活性。二 Mg2+:终浓度为1.52.0mmol/L，其对应dNTP为200 mol/L，留意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度到
5、达1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反响的特异性和产率。三BSA(牛血洁白蛋白：普通用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有维护作用。四底物dNTPs：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，普通存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反响终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反响，但同时添加错误掺入和实验本钱；低浓度可提高准确性，而反响速度会降低。五Taq酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为7580，普通用72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原那么为根底，按53方向逐个
6、将dNTP分子衔接到引物的3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无35的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会添加其错配率。用量普通为0.55个单位/100l。六模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反响有抑制造用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否那么扩增能够不会胜利，在此情况下可适当稀释模板。七引物：引物浓度普通为0.10.5mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低那么得不到产物或产量过低。引物长度普通1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3
7、末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G因T错配也能引发链的延伸。引物G C约占4555%，碱基应尽量随机分布，防止嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。PCRPCR反响条件的选择影响要素反响条件的选择影响要素温度参数：温度参数：1.1.变性：模板变性完全与否是变性：模板变性完全与否是PCRPCR胜利的关键，普通先于胜利的关键，普通先于9494或或9595变变性性3 310min10min，接着，接着9494变性变性303060s60s。2.2.退火：退火温度普通低于引物本身变性温度退火：退火温度普通低于引物本身变性温度55。引物长度在。引物长度
8、在151525bp25bp可可经过公经过公Tm=(G C)Tm=(G C)4(A T)4(A T)22计算退火温度，普通退火温度在计算退火温度，普通退火温度在40406060之之间，时间为间，时间为303045s45s。假设。假设(G C)(G C)低于低于50%50%，退火温度应低于，退火温度应低于5555。较高的退。较高的退火温度可提高反响的特异性。火温度可提高反响的特异性。3.3.延伸：延伸温度应在延伸：延伸温度应在TaqTaq酶的最适温度范围之内，普通在酶的最适温度范围之内，普通在70707575。延伸。延伸时间要根据时间要根据DNADNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常
9、对于聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb1kb以内的片段以内的片段1min1min是够用的。是够用的。循环数：循环数：PCRPCR的循环数主要由模板的循环数主要由模板DNADNA的量决议，普通的量决议，普通20203030次循环数较适宜，过多的次循环数较适宜，过多的循环数会添加非特异扩增产物，详细要多少循环数可经过预实验确定。循环数会添加非特异扩增产物，详细要多少循环数可经过预实验确定。PCR常见问题常见问题一.没有扩增产物 1.循环温度：变性温度、退火温度 2.引物设计 3.DNA聚合酶活性 4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份)5、DNA样品 二.
10、非特异产物及电泳呈涂布状 1.Mg2 浓度 2.调整引物、模板、聚合酶的用量 3.适当减少循环数 4.适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间 三.引物二聚体的构成 1.检查引物的序列 2.提高退火温度 3.调整引物与模板浓度 4.添加引物长度 四.假阳性结果的预防 1、实验器材应一次性运用(吸咀、PCR管)2、留意操作环境，戴一次性手套 3、严厉PCR操作规程 4、多次取样的试剂应分装 5、设置阴性对照和阳性对照 PCR相关技术相关技术 一.锚定PCR(anchored PCR)：引进锚定引物，可以协助抑制序列未知或序列未全知的妨碍。在DNA3-末端加上poly(dG)尾，与此相对应的锚定引物p
11、oly(dC)普通应在十二聚体以上。二.不对称PCR(asymmetric PCR)不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物耗费殆尽，其扩增产物减少以致于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物即单链DNA逐渐添加，可得到大量单链DNAssDNA用于直接测序。四.多重PCR(multiplex PCR)多重PCR是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进展扩增。多重PCR技术的难点不是在于其原理和操作的复杂性，而是在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不构成引物二聚体，引物与目的模板区域具有高度特异性。
12、运用于基因诊断，对与疾病相关的基因庞大进展扩增检测。五.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)由mRNA逆转录产生cDNA链作为PCR反响模板。逆转录合成cDNA时，引物可选用特异引物、随机六聚体引物或寡聚dT(12-18)。设计RT-PCR的引物时最好是分散在不同的外显子上，以免基因组DNA的污染导致假阳性结果 六.差别PCR(differential PCR)差别PCR是将靶基因与知拷贝的参照基因置于同一PCR反响体系中，用同一套引物进展扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进展定量。七.原位PCR(In s
13、itu PCR)原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进展PCR，对细胞中的靶DNA进展扩增，经过掺入标志基团直接显色或结合原位杂交进展检测的方法。可分为直接法和间接法。根本步骤：组织切片或细胞固定蛋白酶消化原位PCR扩增冲洗产物检测优点：灵敏度高，可进展细胞内定位 八.荧光定量PCR(FQ-PCR)荧光定量PCR：融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标志有荧光报告基团和荧光淬灭基团)，结合先进的光谱检测技术开展起来的一项新技术。主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针，PCR过程中，具有53外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时，将DNA探针逐个降解，释放出荧光报告基团，这样PCR体系中
14、荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系，可经过测定荧光强度而对PCR产物定量。荧光定量PCR的优点：1.可进展准确的定量检测。用于基因诊断。2.定量范围宽。3.特异性更强，抑制了假阳性。4.操作简单快速，无须后处置和电泳检测。5.平安，技术易于学习，易于进展电脑化 数据管理。PCR技术的运用技术的运用1.遗传性疾病的基因诊断遗传性疾病的基因诊断2.传染病的诊断传染病的诊断(肝炎病毒肝炎病毒)3.癌基因检测癌基因检测4.法医学法医学(亲子鉴定亲子鉴定)上的运用上的运用5.DNA测序测序6.基因克隆基因克隆7.引入基因点突变引入基因点突变,基因交融等基因交融等关于亲子鉴定 人类基因组是一个构造非
15、常稳定的体系，同时又是一个变异的体系，在长期的进化过程中，基因组 DNA的序列不断发生变异。这些变异有些被保管下来，导致了不同种族，群体和个体基因组的差别和多态性，除同卵双生子外，没有两个个体基因组是完全一样的。吴乃虎 P112 用随机引物扩增出来的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳之后呈现的带型，反响了模板DNA分子的总体特征。假设起始资料用的是细胞的总DNA，那么扩增的带型代表着细胞基因组的构造特征，因此用随机引物的PCR 扩增可以测定除两个生物体基因组之间的差别。两个物种的个体之间，亲缘关系越近，其相应的PCR扩增带型也就越类似，反之差别就越悬殊。这种技术也称为随机扩增多态DNA分析引物(random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)美一研讨小组试图经过RAPD技术分析检测松树是具有异常尾巴的一种兔子的假说，结果阐明，松树和兔子的RAPD带型差别显著，从而否认了这个假说。图p113
PCR原理技术与应用附教学用ppt课件
