现代生物制药技术

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1、 生生 物物 制制 药药 技技 术术第二章第二章 基因工程制药基因工程制药第三章第三章 细胞工程制药细胞工程制药第四章第四章 酶工程制药酶工程制药第五章第五章 动植物细胞培养技术制药动植物细胞培养技术制药第六章第六章 生物药物的提取纯化技术生物药物的提取纯化技术第一章第一章 绪论绪论 第一章第一章 绪论绪论第一节第一节 生物制药的概念和内容生物制药的概念和内容生物制药生物制药是指利用生物体或生物过程是指利用生物体或生物过程生产药物的技术。生产药物的技术。分类：分类：发酵工程制药发酵工程制药 基因工程制药基因工程制药 细胞工程制药细胞工程制药 酶工程制药酶工程制药第二节第二节 生物药物的性质与分

2、类生物药物的性质与分类生物药物的性质生物药物的性质 优点优点：毒性低、副作用小、疗效可靠。特：毒性低、副作用小、疗效可靠。特异性异性 特别要提到的是利用重组特别要提到的是利用重组DNA 技术技术生产生产 的药品，即新生物技术药品，或简的药品，即新生物技术药品，或简称生物新药。称生物新药。劣点劣点：1 成分复杂成分复杂 2 不稳定、易变性、易失活不稳定、易变性、易失活 3 易为微生物污染、破坏易为微生物污染、破坏 4 生产条件的变化对产品质量影响较生产条件的变化对产品质量影响较大大 二二 生物新药的质量保证生物新药的质量保证要点要点：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳：产品的鉴别、纯度、活性、安

3、全性、稳定性和抑制性。定性和抑制性。鉴定方法鉴定方法电泳方法、免疫学分析方法、受体结合实验、电泳方法、免疫学分析方法、受体结合实验、各种高效液相色谱分析法、肽图分析法、各种高效液相色谱分析法、肽图分析法、Edman N-末端序列分析法、圆二色谱法、核磁末端序列分析法、圆二色谱法、核磁共振法共振法安全性评价安全性评价无病毒、无菌、无热源、无致敏源无病毒、无菌、无热源、无致敏源致突变、致癌和致畸致突变、致癌和致畸 三三 生物药物的分类生物药物的分类1 氨基酸类氨基酸类2 有机酸、醇酮类有机酸、醇酮类3 维生素维生素4 酶及辅酶类酶及辅酶类（1）酶类药物）酶类药物：助消化酶类；消炎酶类；：助消化酶类

4、；消炎酶类；心血管疾病治疗酶；心血管疾病治疗酶；抗肿瘤酶；抗肿瘤酶；其他酶类：超氧化物歧化酶其他酶类：超氧化物歧化酶 （SOD）PEG-腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶 RNA酶酶（2）辅酶类药物：）辅酶类药物：ATP NAD CoA FAD5 脂类脂类（1）磷脂类）磷脂类（2）多价不饱和脂肪酸（）多价不饱和脂肪酸（PUFA）和前列腺素）和前列腺素（3）胆酸类）胆酸类 （4）固醇类）固醇类 （5）卟啉类）卟啉类6 多肽和蛋白质类多肽和蛋白质类 人体内的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和细人体内的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和细 胞生长因子。胞生长因子。红细胞生成素（红细胞生成素（EPO）白细胞介素白细

5、胞介素-2（IL-2）粒细胞集落刺激因子（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）粒粒/巨噬细胞集落刺激因子（巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（TNF）表皮生长因子（表皮生长因子（EGF）（用于伤口愈合）（用于伤口愈合）7 核酸类及其衍生物核酸类及其衍生物（1）核酸类）核酸类 （2）多聚核苷酸）多聚核苷酸 （3）核苷、核苷酸及其衍生物）核苷、核苷酸及其衍生物 8 多糖多糖升白：增加白细胞升白：增加白细胞（1）抗生素）抗生素 （2）酶抑制剂）酶抑制剂 （3）免疫调节物质）免疫调节物质 （4）其他生物活性物质）其他生物活性物质第三节第三节 新型生物药物研制的理论和方法新型生物

6、药物研制的理论和方法新的化学实体（新的化学实体（New chemical entity，简称，简称NCE）根据根据NCE来源将生物药物大致分为两类：来源将生物药物大致分为两类：一类是利用重组一类是利用重组DNA技术技术二类是利用微生物、动植物或酶生产的非上述药品，通过二类是利用微生物、动植物或酶生产的非上述药品，通过筛远可获得这类新药的筛远可获得这类新药的NCE的先导物。的先导物。新药研究和开发的主要过程：新药研究和开发的主要过程：1 确定研究计划确定研究计划 2 准备化合物准备化合物 3 药理筛选药理筛选4 化学试验化学试验 5 临床前临床前I期期 6 临床前临床前II期期7 I期临床期临床

7、 8 II期临床期临床 9 III期临床期临床10注册申请上市注册申请上市 11售后监测售后监测提供提供6000-8000个化合物个化合物 9-13年年 耗资约耗资约2.3亿美元亿美元先导化合物的寻找先导化合物的寻找1 筛选模型的确定筛选模型的确定筛选模型的核心是药物作用靶筛选模型的核心是药物作用靶大规模筛选（大规模筛选（High-throughput screening，简称，简称HTS）（1）用动物细胞和组织建立的筛选模型）用动物细胞和组织建立的筛选模型 LC50（2）酶抑制剂的筛选）酶抑制剂的筛选（3）受体拮抗剂的筛选）受体拮抗剂的筛选基因复制、转录因子为对象的治疗基因复制、转录因子为对

8、象的治疗（1）转录因子的多样性）转录因子的多样性 （2）转录因子具有特异性）转录因子具有特异性（3）基因特异性转录因子与人类疾病有关）基因特异性转录因子与人类疾病有关开始考虑以凋亡为靶治疗开始考虑以凋亡为靶治疗2 先导化合物来源先导化合物来源一是从化学库或天然产物中筛选一是从化学库或天然产物中筛选二是与受体结合的结构设计（合理新药设计）二是与受体结合的结构设计（合理新药设计）合理药物设计（合理药物设计（Rational drug design）则是基于）则是基于受体三维立体结构的认识，通过计算机辅助分受体三维立体结构的认识，通过计算机辅助分子设计全程合成新分子。子设计全程合成新分子。现今从生物

9、中筛选新药重点放在微生物现今从生物中筛选新药重点放在微生物人们也开始关注植物、动物人们也开始关注植物、动物人类和动物方面，则关注自身免疫系统人类和动物方面，则关注自身免疫系统新药的研究与开发是一个将化学结构研究与生物活新药的研究与开发是一个将化学结构研究与生物活性研究连接起来的创造性过程。性研究连接起来的创造性过程。第四节第四节 生物药物的发展历史和概况生物药物的发展历史和概况生物制药的发展历史生物制药的发展历史李时珍李时珍本草纲目本草纲目医生琴纳（医生琴纳（Jenner）发明了用牛痘疫苗治疗天花）发明了用牛痘疫苗治疗天花1860年，巴斯德发现细菌，开创了第一次药学革命年，巴斯德发现细菌，开创

10、了第一次药学革命1928年英国弗莱明发明青霉素至年英国弗莱明发明青霉素至1941年在美国开发成年在美国开发成功。功。从生物体内分离纯化酶制剂的技术日趋成熟，酶类药从生物体内分离纯化酶制剂的技术日趋成熟，酶类药物得物得到广泛应用。到广泛应用。70年代年代Zenk 应用植物细胞培养生产植物药物应用植物细胞培养生产植物药物50年代提出的年代提出的DNA 双螺旋理论及双螺旋理论及70年代发展的重组年代发展的重组DNA技术、单克隆抗体技术使生物制药进入一崭新的时代技术、单克隆抗体技术使生物制药进入一崭新的时代1982年，第一个基因工程药物人胰岛素上市年，第一个基因工程药物人胰岛素上市另一重大认识就是认识

11、到生物多样性对生物制药的决定性另一重大认识就是认识到生物多样性对生物制药的决定性在基因工程和细胞工程技术方面的研究水平与国外水在基因工程和细胞工程技术方面的研究水平与国外水平相比差距已不大，国内已建立了平相比差距已不大，国内已建立了40多个临床药理试多个临床药理试验基地。验基地。二二 生物制药的发展概况生物制药的发展概况1 基因工程基因工程 所依托的基础理论为所依托的基础理论为Watson-Crick的的DNA 模板学说模板学说、Monod和和Jacob的操纵子学说。的操纵子学说。（1）基因工程药物品种的开发）基因工程药物品种的开发（2）应用基因工程技术建立新药的筛选模型）应用基因工程技术建立

12、新药的筛选模型（3）应用基因工程技术改良菌种）应用基因工程技术改良菌种（4）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用（5）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物（6）基因工程抗体在医药工业中的应用）基因工程抗体在医药工业中的应用 抗体工程抗体工程细胞工程细胞工程 奠定了细胞培养和细胞融合技术的理论基础奠定了细胞培养和细胞融合技术的理论基础2（1）单克隆抗体技术）单克隆抗体技术 生物导弹生物导弹（2）通过植物细胞培养生产次生代谢产物）通过植物细胞培养生产次生代谢产物（3）动物细胞培养）动物细胞培养 三三 微生物工程微生物工程微

13、生物工程也称发酵工程微生物工程也称发酵工程所采用的新技术主要应用于所采用的新技术主要应用于3个方面：个方面：工艺改进、新药研制和菌种改造。工艺改进、新药研制和菌种改造。微生物药物：微生物药物：即在微生物生命活动过程中产生的具有生理活性即在微生物生命活动过程中产生的具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物及其衍生物。（或称药理活性）的次级代谢产物及其衍生物。有酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、抗氧化剂。有酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、抗氧化剂。四四 酶工程酶工程 酶工程是酶学与化工技术二者结合的产物酶工程是酶学与化工技术二者结合的产物 第五节第五节 生物制药的发展趋势生物制药的发展趋势 一

14、一 生物制药中的新技术生物制药中的新技术1 大规模筛选的采用与创新大规模筛选的采用与创新 大规模筛选是大规模测试化合物的方法，采用机大规模筛选是大规模测试化合物的方法，采用机器人自动寻找特殊生物靶，如某个细胞表面受体或器人自动寻找特殊生物靶，如某个细胞表面受体或一个代谢有关酶的抑制剂（拮抗剂）或激动剂（兴一个代谢有关酶的抑制剂（拮抗剂）或激动剂（兴奋剂）的技术。奋剂）的技术。2 高效分离纯化系统的采用高效分离纯化系统的采用（1）固相化金属亲和层析）固相化金属亲和层析 （2）超扩散层析）超扩散层析（3）灌注层析）灌注层析 BioCADworkstation（4）其他快速分离纯化系统）其他快速分离

15、纯化系统AKTA explorer快速化工工艺开拓系统快速化工工艺开拓系统Streamline扩张柱床吸附技术扩张柱床吸附技术快速蛋白液相色谱（快速蛋白液相色谱（FPLC）The biological system 高分辨生物分子纯化而设计的层高分辨生物分子纯化而设计的层析系统析系统 二二 Human genome project，简称，简称 HGP约约10万个万个gene30亿对碱基亿对碱基 三三 基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗从基因角度可以理解为将外来的基因导从基因角度可以理解为将外来的基因导入细胞，用正常的基因置换病源基因或补充缺失入细胞，用正常的基因置换病源基因或补充缺失的基因，从而

16、达到治疗的效果。的基因，从而达到治疗的效果。基因治疗的疾病有三类：基因治疗的疾病有三类：致死性遗传性疾病致死性遗传性疾病 用过去的治疗法很难根治的癌症用过去的治疗法很难根治的癌症 爱滋病等后天性疾病爱滋病等后天性疾病RNA 病毒可望用病毒可望用RNA 酶消灭酶消灭图图1-4为用核酸酶（为用核酸酶（RNA 酶）酶）解决的问题：提供更多可供利用的基因解决的问题：提供更多可供利用的基因设计定向整合的载体：反转录病毒和腺病毒设计定向整合的载体：反转录病毒和腺病毒人类将逐渐具备在原子水平解决问题和在基因水人类将逐渐具备在原子水平解决问题和在基因水平上治疗疾病的能力。平上治疗疾病的能力。四四 糖链工程糖链

17、工程糖科学（糖科学（Glycoscience）和糖链工程）和糖链工程 即糖生物学即糖生物学蛋白或糖脂类蛋白或糖脂类 对生态信息的传递起着重要的作用对生态信息的传递起着重要的作用糖类药物糖类药物 五五 细胞因子类药物细胞因子类药物 细胞因子细胞因子是淋巴细胞来源的淋巴因子或巨噬细胞、单是淋巴细胞来源的淋巴因子或巨噬细胞、单核细胞来源的单核因子、免疫系统中具有各种生物活核细胞来源的单核因子、免疫系统中具有各种生物活性的一类因子的总称。性的一类因子的总称。对细胞因子的受体结构以及细胞因子糖链部分的结构对细胞因子的受体结构以及细胞因子糖链部分的结构和功能也做了大量研究。和功能也做了大量研究。第二章第二

18、章 基因工程制药基因工程制药 第一节第一节 基因工程制药概述基因工程制药概述 基因工程（基因工程（Gene engineering），又称，又称重组重组DNA 技术。技术。它能使带有支配各种各样遗传信息基因的它能使带有支配各种各样遗传信息基因的DNA 片段越过不片段越过不同生物间特异的细胞壁而组入到完全不同的生物体内，定同生物间特异的细胞壁而组入到完全不同的生物体内，定向的控制、修饰和改变生物体的遗传和变异。向的控制、修饰和改变生物体的遗传和变异。人胰岛素（人胰岛素（Insulin）具有多种生物功能，维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某具有多种生物功能，维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋

19、白质的合成。些氨基酸和蛋白质的合成。生产方式：一是分别在大肠杆菌中合成生产方式：一是分别在大肠杆菌中合成A 链和链和B 链，再在链，再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。另一种是用分泌型载体表达胰岛素原。另一种是用分泌型载体表达胰岛素原。2 人生长激素人生长激素人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素。基化多肽激素。刺激身体生长刺激身体生长hGH 对一些细胞的增殖和分化以及对一些细胞的增殖和分化以及DNA 合成有直接效应。合成有直接效应。干扰素（干扰素（Interferon，IFN）同

20、种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA 和蛋白质的和蛋白质的合成。合成。本身不能直接灭活病毒，而是细胞在干扰素作用后产生本身不能直接灭活病毒，而是细胞在干扰素作用后产生出多种抗病毒蛋白，从而阻断病毒的繁殖。出多种抗病毒蛋白，从而阻断病毒的繁殖。分为分为a b tb t三型三型基本特性包括种属特异性、作用广谱性和选择基本特性包括种属特异性、作用广谱性和选择性、相对无害性和特殊稳定性。性、相对无害性和特殊稳定性。抗细胞内侵害微生物活性；抗细胞分裂活性；抗细胞内侵害微生物

21、活性；抗细胞分裂活性；调节免疫功能活性。调节免疫功能活性。用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病4 白细胞介素白细胞介素白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的又白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的因子，是在白细胞间起调节作用和介导作用的因子，是一类重要的免疫调节剂。一类重要的免疫调节剂。激活并刺激激活并刺激T、B淋巴细胞的增殖和分化淋巴细胞的增殖和分化 刺激巨噬细胞和粒细胞的活性刺激巨噬细胞和粒细胞的活性 各种细胞的丝裂原各种细胞的丝裂原 治疗恶性肿瘤和病毒性疾病治疗恶性肿瘤和病毒性疾病5 集落刺激因子集落刺激因子是一类能参与造血调节过程的

22、糖蛋白分子，是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子，又称造血刺激因子或造血生长因子。又称造血刺激因子或造血生长因子。分类：分类：粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子 巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子 粒细胞粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子 多能集落刺激因子多能集落刺激因子功能：功能：刺激造血细胞增殖、维系细胞存活、分化刺激造血细胞增殖、维系细胞存活、分化 定型、刺激终末细胞的功能活性定型、刺激终末细胞的功能活性临床多用作癌化疗的辅助药物临床多用作癌化疗的辅助药物6 促红细胞生成素促红细胞生成素肾脏分泌的重要激素肾脏分泌的重要激素与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关与

23、多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血7 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子除具有抗肿瘤外，还有抗炎活性，促凝血活性，促进细胞因除具有抗肿瘤外，还有抗炎活性，促凝血活性，促进细胞因子分泌，免疫调节作用，抗病毒、细菌和真菌作用，热原质子分泌，免疫调节作用，抗病毒、细菌和真菌作用，热原质以及参与骨质重吸收以及参与骨质重吸收淋巴细胞毒素淋巴细胞毒素8 组织型纤溶酶原激活剂组织型纤溶酶原激活剂tPA是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤熔酶，纤溶

24、是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤熔酶，纤溶 酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解。酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解。主要用于治疗血栓性疾病主要用于治疗血栓性疾病9 心钠素心钠素较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿、气喘治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿、气喘10 重组乙肝疫苗重组乙肝疫苗美、法和德国都已研制出人工合成的前美、法和德国都已研制出人工合成的前S多肽疫苗，具有很多肽疫苗，具有很强的免疫原性强的免疫原性由化学合成的由化学合成的H BsAg多肽与破伤风类毒素偶联形成复合蛋多肽与破

25、伤风类毒素偶联形成复合蛋白分子制成的疫苗白分子制成的疫苗第二节第二节 基因工程制药中常用的基因工程制药中常用的 工具酶和克隆载体工具酶和克隆载体 一一 常用工具酶常用工具酶1 限制酶限制酶它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些独特的性质上具有一些独特的性质种类：种类：I型酶型酶 II型酶：简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或型酶：简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需只需Mg2+，能识别双链，能识别双链DNA 上特异的核苷酸序列，底上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。物作用的专一性强，而且

26、其识别序列与切断序列相一致。限制酶的命名限制酶的命名以寄主微生物属名的第一个字母（大写）和种名的前两以寄主微生物属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的个字母（小写）写成斜体字的3 个字母个字母 缩写，菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同缩写，菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同 一菌株中有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区一菌株中有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。分。例如例如 HindIII限制酶的特性限制酶的特性（1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（2）各种限制酶的识别序列都具有回文

27、结构）各种限制酶的识别序列都具有回文结构 双重旋转对称排列双重旋转对称排列 回文结构回文结构 即正读与反读都相同即正读与反读都相同（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种 粘性末端或平整末端粘性末端或平整末端 错位切断错位切断DNA-Cohesive ends Flush ends识别序列不同的限制酶，切割后有可能产生相同的粘性末端。识别序列不同的限制酶，切割后有可能产生相同的粘性末端。同切口限制酶或同裂酶同切口限制酶或同裂酶 在连接酶的作用下，可以得到嵌合在连接酶的作用下，可以得到嵌合DNA，称为异源二聚体。，称为异源二聚体。来源不同

28、的限制酶，其识别序列可以相同，但其切点位置可不来源不同的限制酶，其识别序列可以相同，但其切点位置可不 同或相同。同或相同。（4）某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变别序列特异性发生改变在非标准条件下，每种限制酶都有上述严格的识别序列在非标准条件下，每种限制酶都有上述严格的识别序列导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA 内产生附加切内产生附加切割。称为限制酶的第割。称为限制酶的第2活性，又称为星活性。活性，又称为星活性。2 DNA 聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶I

29、（1）5-3DNA 聚合酶活力聚合酶活力（2）5-3外切核酸酶活力外切核酸酶活力 降解降解RNA：DNA 杂交体的杂交体的RNA 部分部分（3）3-5外切核酸酶活力外切核酸酶活力主要功能是校对所合成的链是否能与模板精确无误地配对在一起。主要功能是校对所合成的链是否能与模板精确无误地配对在一起。切口平移反应：当双链切口平移反应：当双链DNA 的一条链产生缺口时，的一条链产生缺口时，DNA 聚合聚合酶酶I将脱氧核苷酸添加到将脱氧核苷酸添加到3羟基末端上，与此同时，其羟基末端上，与此同时，其5-3外切酶外切酶从切口的从切口的5磷酸末端切除原有核苷酸磷酸末端切除原有核苷酸,使切口沿着使切口沿着DNA

30、平移平移,称为切称为切口平移反应口平移反应,又称为又称为缺口翻译缺口翻译。以放射性脱氧核苷酸置换原来的脱氧核苷酸标记以放射性脱氧核苷酸置换原来的脱氧核苷酸标记DNA，从而制，从而制作作DNA 探针。探针。大片段即大片段即Klenow 片段片段是用枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解完整的是用枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解完整的DNA 聚聚合酶合酶I而产生或者通过克隆技术而得到的单一多肽链。而产生或者通过克隆技术而得到的单一多肽链。全酶中去除了全酶中去除了5-3外切核酸酶活力，而聚合酶活力及外切核酸酶活力，而聚合酶活力及3-5外切核酸外切核酸酶活力均不受影响。酶活力均不受影响。补平限制酶切割补平限制酶切割DNA 后产

31、生的后产生的3凹端凹端 用用32PdNTP 补平补平3凹端，对凹端，对DNA 片段进行末端标记片段进行末端标记 在在cDNA 克隆中，用于合成克隆中，用于合成cDNA 第二链第二链 应用应用Sanger双脱氧链末端终止法进行双脱氧链末端终止法进行DNA 测序测序 T4 噬菌体噬菌体DNA 聚合酶聚合酶 与与Klenow 片段相似的是都具有片段相似的是都具有5-3聚合酶活力及聚合酶活力及3-5外切核酸酶外切核酸酶活力，而且活力，而且3-5外切酶活力对单链外切酶活力对单链DNA 的作用比对双链的作用比对双链DNA 更强。更强。经修饰的经修饰的T7 噬菌体噬菌体DNA 聚合酶聚合酶 更强的更强的3-

32、5外切核酸酶活力外切核酸酶活力 DNA 平均长度比其他聚合酶大得多平均长度比其他聚合酶大得多 拷贝长段模板拷贝长段模板 测序酶，测序酶（测序酶，测序酶（2.0版）完全丧失了核酸外切酶活力版）完全丧失了核酸外切酶活力 Taq DNA 聚合酶及聚合酶及AmpliTaqTM DNA 聚合酶聚合酶 水生栖热菌水生栖热菌 具有具有5-3聚合酶活力和依赖于聚合作用的聚合酶活力和依赖于聚合作用的5-3外切核酸酶活力。外切核酸酶活力。最佳作用温度为最佳作用温度为75-80。C，为避免引物自模板上解离往往需在，为避免引物自模板上解离往往需在低于最适温度条件下起始聚合反应。低于最适温度条件下起始聚合反应。聚合酶链

33、式反应聚合酶链式反应 反转录酶反转录酶鼠或禽反转录病毒鼠或禽反转录病毒 H活力活力主要用于将主要用于将 mRNA 转录成双链转录成双链cDNA，也可用于制备，也可用于制备杂交用探针和标记带杂交用探针和标记带5突出端的突出端的DNA 片段。片段。DNA 连接酶连接酶 能将两段能将两段DNA 拼接起来的酶叫拼接起来的酶叫DNA 连接酶。连接酶。T4噬菌体噬菌体DNA 聚合酶聚合酶连接带有匹配粘性末端的双链连接带有匹配粘性末端的双链DNA连接平整末端的双链连接平整末端的双链DNA 大肠杆菌大肠杆菌DNA 连接酶连接酶 需需NAD 辅助因子辅助因子基因工程中常用的其他酶基因工程中常用的其他酶末端脱氧核

34、苷酸转移酶（简称末端转移酶或末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶或TDT酶）酶）作用底物是带作用底物是带3羟基端的单链羟基端的单链DNA 或带或带3羟基突出端的双链羟基突出端的双链DNA。主要用于给载体或主要用于给载体或cDNA 加上互补的同聚尾以及用加上互补的同聚尾以及用32P 标记的一种标记的一种d NTP 来标记来标记DNA 片段的片段的3端。端。T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶它能催化它能催化ATP 的的-磷酸基转移至去磷酸化的磷酸基转移至去磷酸化的DNA 或或RNA 的的5末端末端该酶可用于标记该酶可用于标记DNA 5末端末端 核酸酶核酸酶 BLA31核酸酶核酸酶 主要活力是

35、主要活力是3外切核酸酶活力，外切核酸酶活力，DNA 内切酶活力内切酶活力 反应绝对依赖于钙离子反应绝对依赖于钙离子（1）通过可控方式去除双链）通过可控方式去除双链DNA 的末端核苷酸从而缩短的末端核苷酸从而缩短DNA 分子分子（2）用于确定）用于确定DNA 小片段的限制酶切图小片段的限制酶切图 S1核酸酶核酸酶 单链特异性的内切酶单链特异性的内切酶 可降解单链可降解单链DNA 或或RNA（1）去除）去除DNA 片段中突出的单链尾部片段中突出的单链尾部（2）打开从）打开从 mRNA 合成双链合成双链cDNA 时产生的时产生的发夹环发夹环 碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 细菌碱性磷酸酯酶（细菌碱性磷酸酯

36、酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酯酶（）和牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）两种）两种 催化去除单链或双链催化去除单链或双链DNA 和和RNA 分子中的分子中的5-磷酸基（脱磷酸作用）磷酸基（脱磷酸作用）去除切割载体去除切割载体DNA 两端的两端的5-磷酸基，防止自身环化磷酸基，防止自身环化 二二 常用的克隆载体常用的克隆载体 具有在细胞内进行自我复制的具有在细胞内进行自我复制的DNA 子就是外源子就是外源DNA 片段（基因）的片段（基因）的运载体，又可称为分子载体或无性繁殖载体。运载体，又可称为分子载体或无性繁殖载体。有了复制子作为外源有了复制子作为外源DNA 的载体的载体质粒质粒 质粒质粒（Plas

37、mid）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状双链的小型双链的小型DNA 分子。分子。质粒载体的改造和构建质粒载体的改造和构建 特性特性 （1）要有复制子）要有复制子 （2）要有能促进外源）要有能促进外源DNA 高水平表达的调控区，如含有强启动子高水平表达的调控区，如含有强启动子 （3）要有多种限制酶的单一切点）要有多种限制酶的单一切点 （4）具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转）具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转化体的选择标记（最好有一个具有插入性失活功能）。化体的选择标记（最好有一个具有插入性失活

38、功能）。（5）质粒载体）质粒载体DNA 的分子量要尽可能小，以利于载体容纳较长区段外源的分子量要尽可能小，以利于载体容纳较长区段外源DNA 片段。片段。（6）应属于松弛型复制）应属于松弛型复制 （7）质粒载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱）质粒载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱导。导。阶段阶段 （1）将选择标记引入含有）将选择标记引入含有pMB I或或ColE1复制子的质粒中复制子的质粒中 pBR322 仅仅4.36kb （2）调整质粒载体的结构，提高质粒载体的效率）调整质粒载体的结构，提高质粒载体的效率 新型载体都引入一个人工合成的由多种常用限制酶单一

39、识别序列组新型载体都引入一个人工合成的由多种常用限制酶单一识别序列组成的多克隆位点或多聚接头。成的多克隆位点或多聚接头。（3）引入多种用途的辅助序列，构建具有某些特化功能的质粒载体）引入多种用途的辅助序列，构建具有某些特化功能的质粒载体 构建可用组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体构建可用组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体 如如pUC 载体带有一个载体带有一个Lac操纵子的操纵子的DNA 片段，该区段编码片段，该区段编码bb-半乳糖半乳糖苷酶氨基端的一个片段，该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型苷酶氨基端的一个片段，该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型bb-半乳糖半乳糖苷酶实现基因内互补。外源苷酶实现基

40、因内互补。外源DNADNA插入载体的多克隆位点后，可使酶的氨基插入载体的多克隆位点后，可使酶的氨基端片段失活而破坏这种互补作用，导致带有重组质粒的细菌在含有诱导端片段失活而破坏这种互补作用，导致带有重组质粒的细菌在含有诱导物物IPTGIPTG和生色底物和生色底物X-galX-gal培养基上产生白色菌落，从而可用肉眼鉴定重组培养基上产生白色菌落，从而可用肉眼鉴定重组克隆。克隆。构建带有单链噬菌体复制起点的质粒载体构建带有单链噬菌体复制起点的质粒载体 可大量获得载体可大量获得载体DNA 双链中的一条链双链中的一条链 构建带有噬菌体启动子的质粒载体构建带有噬菌体启动子的质粒载体 体外得以转录体外得以

41、转录RNA 而翻译而翻译 构建可对重组克隆进行正选择的质粒载体构建可对重组克隆进行正选择的质粒载体 某些宿主菌致死的基因产物某些宿主菌致死的基因产物 构建含有强启动子的质粒载体构建含有强启动子的质粒载体 常用的几种质粒载体常用的几种质粒载体（1）pBR322 及其衍生载体及其衍生载体 非必需区域，分子量相对较大，能被非必需区域，分子量相对较大，能被Colk 带动转移带动转移 有关转移的有关转移的mob 区段刚好在非必需区域内区段刚好在非必需区域内 pAT153载体载体 之间缺失之间缺失2个片段个片段 包含结合转移的有关序列包含结合转移的有关序列 pBR327载体载体 （2）pUC系列载体系列载

42、体 pUC18、pUC19质粒载体质粒载体 pUC质粒缺乏与控制拷贝数有关的质粒缺乏与控制拷贝数有关的rop 基因，故这些质粒复制的拷贝基因，故这些质粒复制的拷贝数要比带有数要比带有pMB1或或ColE1复制起点的质粒高得多。复制起点的质粒高得多。PUC118、pUC119质粒载体质粒载体 带有带有M13 丝状噬菌体丝状噬菌体DNA 合成的起始、终止及合成的起始、终止及DNA 包装进入噬菌包装进入噬菌体颗粒所必需的序列。体颗粒所必需的序列。这些质粒的宿主细胞被适当的丝状噬菌体感染时，可合成质粒这些质粒的宿主细胞被适当的丝状噬菌体感染时，可合成质粒DNA 中一条链，并能将此单链中一条链，并能将此

43、单链DNA 包装进入子代噬菌体。包装进入子代噬菌体。pUC 的衍生质粒载体的衍生质粒载体 噬菌体编码的依赖于噬菌体编码的依赖于DNA 的的RNA 聚合酶转录单位的启动子聚合酶转录单位的启动子噬菌体噬菌体噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建 噬菌体基因组为双链线状噬菌体基因组为双链线状DNA 感染时，感染时，DNA 的两末端配对并由连接酶的作用闭合成环状的两末端配对并由连接酶的作用闭合成环状（1）A至至J区段：分布在基因组左臂，约占区段：分布在基因组左臂，约占1/3基因组。基因组。噬菌体头部（噬菌体头部（A-F）、尾部（）、尾部（Z-J）（2）J至至N之间非必需区段：约占之间非必需区段：约占1/3基

44、因组基因组 控制重组及溶源性的基因，可被消除和取代控制重组及溶源性的基因，可被消除和取代（3）N 至至R 区段：分布在基因组右臂，与噬菌斑的形成有关。区段：分布在基因组右臂，与噬菌斑的形成有关。包括调控及免疫性基因、包括调控及免疫性基因、DNA 复制基因、转录和裂解基因等。复制基因、转录和裂解基因等。消除多余限制性内切酶位点消除多余限制性内切酶位点 消除基因组必需区内的酶切位点，保留非必需区内消除基因组必需区内的酶切位点，保留非必需区内1-2个位点个位点 方法：点突变、基因组的置换和缺失方法：点突变、基因组的置换和缺失 去除去除DNA 中一些非必需区段中一些非必需区段 有有75%-105%38

45、-52 kb DNA 才能被包装成噬菌体颗粒才能被包装成噬菌体颗粒 插入型载体插入型载体 DNA 基因组中缺失部分非必需基因，只含有一个可供外源基因组中缺失部分非必需基因，只含有一个可供外源DNA 插入插入的限制性内切酶位点的的限制性内切酶位点的DNA 载体。载体。替换型载体替换型载体 在在DNA 的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点，酶切后替换的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点，酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右双臂分开，有外源片段与带有所有必需基因的左右双臂分开，有外源DNA 代之。代之。携带外源携带外源DNA 的重组体的正选择标记。的重组体的正选择标记。提高载体在生物学防护

46、上的安全性，引入了提高载体在生物学防护上的安全性，引入了WES三个基因的琥珀突三个基因的琥珀突变，这些特性使从实验室环境中逃逸出重组噬菌体的可能性大大降低。变，这些特性使从实验室环境中逃逸出重组噬菌体的可能性大大降低。Charon16A 载体的基因载体的基因A 和和B 上诱变产生了琥珀突变。上诱变产生了琥珀突变。结果在含有色原底物结果在含有色原底物Xgal和和Lac-指示菌的平板培养基上形成无色的指示菌的平板培养基上形成无色的噬菌斑。噬菌斑。常用载体常用载体（1）Charon系列载体系列载体 Charon40 载体是专门设计用来容纳大片段载体是专门设计用来容纳大片段（2）EMBL系列载体系列载

47、体 EMBL3、EMBL4 对称的两个多酶位点聚合接头序列对称的两个多酶位点聚合接头序列 EMBL3A 带有两个琥珀突变，可筛选出带有两个琥珀突变，可筛选出SUPF（琥珀抑制基因）相联（琥珀抑制基因）相联的的DNA 序列。序列。构建基因文库构建基因文库（3）gt系列载体系列载体 为插入型系列载体，包括为插入型系列载体，包括gt10、pgt11、gt18-23等等 gt10：专门为在其免疫区（：专门为在其免疫区（imm434？）内单一的）内单一的EcoR I位点上克隆位点上克隆小的小的cDNA 片段（约片段（约6kb）而设计的。）而设计的。阻遏子基因阻遏子基因CI，CI基因失活形成了重组的基因失

48、活形成了重组的CI-噬菌体，噬菌斑为噬菌体，噬菌斑为清亮斑，可与非重组的清亮斑，可与非重组的CI-噬菌体所产生的阴暗噬菌斑相区别。噬菌体所产生的阴暗噬菌斑相区别。gt11：是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。：是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。如果插入的如果插入的DNA 片段方向正确且转译读框与片段方向正确且转译读框与LacZ基因一致，基因一致，则重组噬菌体能在宿主菌内指导则重组噬菌体能在宿主菌内指导bb-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。含有对温度敏感的阻遏子（含有对温度敏感的阻遏子（4343。失活），可作为抗溶源性生长的选失活），可作为抗溶源性生长的选择性。择性。M13 噬菌体噬菌体M13 噬

49、菌体的基本特性噬菌体的基本特性 基因组为环状单链基因组为环状单链DNA 分子分子 雄性专一性，即只吸附于带有雄性专一性，即只吸附于带有F质粒的雄性大肠杆菌（质粒的雄性大肠杆菌（F+）的性纤毛）的性纤毛 上而引起感染。上而引起感染。转换成双链复制型（转换成双链复制型（RF）在基因在基因3产物的作用下，以单链产物的作用下，以单链DNA 为模板，先从一个为模板，先从一个RNA 引物开始，引物开始，通过宿主通过宿主DNA 聚合酶聚合酶III延伸，合成双链延伸，合成双链DNA（RFDNA）。）。然后在基因然后在基因2 产物作用下产物作用下RFDNA 进行复制，每个细胞可产生进行复制，每个细胞可产生50-

50、100 RFDNA 拷贝。拷贝。由基因由基因5产生的产生的M13 单链结合蛋白与通过滚环复制合成的单链结合蛋白与通过滚环复制合成的DNA 单链结合单链结合并进行包装形成子代噬菌体。并进行包装形成子代噬菌体。通过细胞壁挤出，并不杀死细胞通过细胞壁挤出，并不杀死细胞 细胞生长速率降低，并不断释放子代噬菌体继续感染周围细胞细胞生长速率降低，并不断释放子代噬菌体继续感染周围细胞 在平板上不形成空斑，形成缓慢生长的慢性感染细胞圈在平板上不形成空斑，形成缓慢生长的慢性感染细胞圈 M13丝状噬菌体载体的构建丝状噬菌体载体的构建 将含有大肠杆菌乳糖操纵子调节区段和编码将含有大肠杆菌乳糖操纵子调节区段和编码bb

51、-半乳糖苷酶基因的头半乳糖苷酶基因的头145145个密码插入这个区的酶切位点，得个密码插入这个区的酶切位点，得M13 mp1M13 mp1，可被转译为多肽。，可被转译为多肽。多肽虽然没有酶活力，但当多肽虽然没有酶活力，但当M13 mp1M13 mp1感染特殊的宿主菌感染特殊的宿主菌JM103JM103时，时，会导致会导致多多互补而产生有活性的互补而产生有活性的b-b-半乳糖苷酶，在含有诱导物的培养半乳糖苷酶，在含有诱导物的培养基上形成蓝色噬菌斑。基上形成蓝色噬菌斑。这两个载体对于具有两个不同酶切位点末端的外源这两个载体对于具有两个不同酶切位点末端的外源DNADNA片段，可通片段，可通过强制克隆

52、而定向连接。过强制克隆而定向连接。常用的常用的M13 噬菌体载体噬菌体载体 M13 mp18、M13 mp19 LacZ区内的多克隆位点中都含有区内的多克隆位点中都含有13个不同的酶切位点个不同的酶切位点 两个载体不会轻易自身再环化两个载体不会轻易自身再环化 外源外源DNA 在在M13 mp18、M13 mp19中以两个互为相反的方向插入中以两个互为相反的方向插入 pBR322质粒载体的复制起点（质粒载体的复制起点（Ori）和氨苄青霉素抗性基因（）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）粘粒粘粒 粘粒是一种有噬菌体粘性末端的杂种质粒，由粘粒是一种有噬菌体粘性末端的杂种质粒，由DNAcos区与质粒区与质

53、粒DNA 重重组构建而成。组构建而成。是为克隆和增殖基因组是为克隆和增殖基因组DNA 的大片段而设计的和组建真核生物基因的大片段而设计的和组建真核生物基因文库文库 最大最大DNA 可达可达52kb，粘粒大小为，粘粒大小为4-7kb，适宜，适宜35-45kb cosDNA 序列（将序列（将DNA 包装到噬菌体颗粒中所必需的序列），携有一包装到噬菌体颗粒中所必需的序列），携有一个复个复制起点（通常是制起点（通常是ColE1复制起点）和一个抗药性标记（通常是复制起点）和一个抗药性标记（通常是Ampr）。）。将两个将两个cos位点组合到同一个粘粒载体中，从而大大简化在粘粒载体位点组合到同一个粘粒载体中

54、，从而大大简化在粘粒载体中的定向克隆。中的定向克隆。哺乳动物细胞载体系统哺乳动物细胞载体系统 一类是不带真核复制子的质粒型载体，是在原核质粒中插入一个一类是不带真核复制子的质粒型载体，是在原核质粒中插入一个完整完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。系统。如如 pTK2、pHyg、pRSVneo 另一类是带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。另一类是带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。5 第三节第三节 基因工程药物无性繁殖系的组建基因工程药物无性繁殖系的组建目的基因的制取目的基因的制取构建基因文库法分离目的

55、基因构建基因文库法分离目的基因1 用一种或两种限制酶消化噬菌体替换型载体，选用适当方法将载体左、用一种或两种限制酶消化噬菌体替换型载体，选用适当方法将载体左、右臂与中间部位的填充片段分离开。右臂与中间部位的填充片段分离开。2 用一种或几种限制酶部分消化高分子量的真核基因组用一种或几种限制酶部分消化高分子量的真核基因组DNA，再用凝胶电，再用凝胶电 泳或密度梯度离心法分离出适宜长度的泳或密度梯度离心法分离出适宜长度的DNA。3 噬菌体载体臂与真核噬菌体载体臂与真核DNA 片段连接成较长的多联体，再利用体外包装系片段连接成较长的多联体，再利用体外包装系 统装入噬菌体头部，成为有感染力的噬菌体。统装

56、入噬菌体头部，成为有感染力的噬菌体。4 重组噬菌体通过在大肠杆菌中生长而得以繁殖，所获得的基因组重组噬菌体通过在大肠杆菌中生长而得以繁殖，所获得的基因组DNA 文文 库可被长时间利用和贮存库可被长时间利用和贮存酶促合成法制取目的基因酶促合成法制取目的基因平均每个细胞约含平均每个细胞约含10-5 g总总RNA Mrna 总总RNA 的的1%-5%从某些特定型别的分化细胞细胞质中，编码某特种蛋白质的目从某些特定型别的分化细胞细胞质中，编码某特种蛋白质的目 mRNA 占总占总 mRNA 的的50%-90%，称为高丰度，称为高丰度 mRNA。低丰度低丰度 mRNA 或稀有或稀有 mRNA 真核细胞的真

57、核细胞的 mRNA 分子在其分子在其3端均有一多聚腺苷酸端均有一多聚腺苷酸poly（A），），20-250个个残基组成的尾，可吸附于寡脱氧胸苷酸残基组成的尾，可吸附于寡脱氧胸苷酸-Oligo（dT）纤维素。纤维素。构建构建cDNA 文库文库 P T-PCR 法法从构建的从构建的cDNA 文库中筛选目的文库中筛选目的cDNA（1）真核细胞总）真核细胞总RNA 的分离的分离 释放的内源性释放的内源性RNA 酶（酶（Rnase）的活力）的活力 外源性外源性Rnase对对RNA 制品的污染制品的污染硫氰酸胍提取和氯化铯离心法硫氰酸胍提取和氯化铯离心法盐酸胍和有机溶剂提取法盐酸胍和有机溶剂提取法（2）带

58、）带poly（A）的）的RNA-mRNA 的分离纯化与分析的分离纯化与分析常用常用Northern杂交（杂交（RNA 印迹法）测定总印迹法）测定总RNA 或或poly（A）RNA 样品中特样品中特定定 mRNA 分子的大小和丰度。分子的大小和丰度。（3）cDNA 文库的构建文库的构建cDNA 第一链的酶促合成第一链的酶促合成 禽源和鼠源反转录酶禽源和鼠源反转录酶cDNA 第二链的合成第二链的合成自身引导法：杂交体变性而分开后，单链自身引导法：杂交体变性而分开后，单链cDNA 端能够形成发夹结端能够形成发夹结构而引导构而引导E.coliDNA 聚合酶聚合酶I Klenow 片段酶促合成片段酶促合

59、成cDNA 第一链。第一链。置换合成法：利用置换合成法：利用cDNA：mRNA 杂交体为切口平移的模板，由杂交体为切口平移的模板，由RNA 酶酶 H在在 mRNA 链上造成切口和缺口而产生一系列链上造成切口和缺口而产生一系列RNA 引物，引物，再由再由DNA 聚聚 合酶合酶I 用这些引物以切口平移反应合成用这些引物以切口平移反应合成cDNA 第二链。第二链。双链双链cDNA 载体载体DNA 的连接的连接噬菌体体外包装及感染构建噬菌体体外包装及感染构建cDNA 文库文库目的目的cDNA 克隆的筛选克隆的筛选核酸杂交法核酸杂交法特异性抗原的免疫学检测法特异性抗原的免疫学检测法cDNA 克隆的同胞选

60、择法克隆的同胞选择法R T-PCR 法合成目的法合成目的cDNA 反转录反转录-聚合酶链式反应聚合酶链式反应从真核生物细胞中提取纯化总从真核生物细胞中提取纯化总RNA在在Oligo(dT)的引导下的引导下,以总以总RNA 中的总中的总 mRNA 为模板为模板,在反转录酶在反转录酶的作用下的作用下,合成总合成总cDNA 的第一链的第一链以两个引物所结合的单链以两个引物所结合的单链cDNA(靶序列靶序列)为模板为模板,在在Taq 聚合酶的作用聚合酶的作用下进行下进行PCR 扩增扩增,合成双链目的合成双链目的cDNA(1)聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）体外扩增）体外扩增DNA 技术技术 P

61、olymerase chain reaction 应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异DNA 序列的拷贝序列的拷贝 宏观与微观的联系宏观与微观的联系PCR 技术的基本原理：首先使双链技术的基本原理：首先使双链DNA 在反应液中热变性而分开成在反应液中热变性而分开成单单 链，然后在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链链，然后在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA 配对配对结合结合 ，再在中温下利用，再在中温下利用Taq DNA 聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合（合（延伸）反应。每经过一次变性、退火、延伸三

62、个步骤为一个循环，延伸）反应。每经过一次变性、退火、延伸三个步骤为一个循环，通通 过三个温度的不同循环。过三个温度的不同循环。PCR 反应体系的组成反应体系的组成a.含靶序列的含靶序列的DNA 需用需用0.2-2g 基因组基因组DNAb.寡核苷酸（引物）寡核苷酸（引物）20-24个核苷酸个核苷酸 1 mol/L 尽量选择碱基随机分布的序列尽量选择碱基随机分布的序列 GC含量尽可能接近含量尽可能接近50%避免因较长的互补序列而形成引物二聚体或发夹结构避免因较长的互补序列而形成引物二聚体或发夹结构 使其使其5端带一罕有的限制酶序列，使扩增产物既含有目标序列，两侧端带一罕有的限制酶序列，使扩增产物既

63、含有目标序列，两侧又带有限制酶切位点。又带有限制酶切位点。Taq DNA 聚合酶聚合酶 工程酶（工程酶（AmpliTaqTM）酶量为酶量为1-5ud.四种四种d NTP 50-200 mol/LPCR缓冲液缓冲液 10 mmol/L Tris HCl（pH 8.3，于室温），于室温）1.5 mmol/L MgCl2 Mg2+为为1.5 mmol/LPCR 体外扩增体外扩增DNA 操作过程操作过程 PCR 自动扩增仪自动扩增仪（2）PCR 扩增由扩增由 mRNA 反转录而成的反转录而成的cDNA 上游上游寡核苷酸引物寡核苷酸引物 下游下游寡核苷酸引物寡核苷酸引物 DNA 体外重组是将目的基因（外

64、源体外重组是将目的基因（外源DNA 片段）用片段）用DNA 连接酶在体连接酶在体外连接到合适的载体外连接到合适的载体DNA 上，这种重新组合的上，这种重新组合的DNA 称为重组称为重组DNA，简，简称称重组体。重组体。目的基因目的基因DNA 与质粒载体与质粒载体DNA 的连接的连接定向克隆法定向克隆法 当用两种不同的限制酶（如用当用两种不同的限制酶（如用BamH I和和Hind III）消化外源）消化外源DNA 时，可以产生带有非互补突出末端的外源时，可以产生带有非互补突出末端的外源DNA 片段。片段。排阻凝胶层析排阻凝胶层析 以便与切下来的小片段分开以便与切下来的小片段分开 避免使用在多克隆

65、位点上彼此直接相邻的限制酶切位点避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点粘性末端连接法粘性末端连接法 质粒载体和外源质粒载体和外源DNA 都可能发生自身环化或形成串联寡聚物都可能发生自身环化或形成串联寡聚物 用碱性磷酸酶去除线状载体用碱性磷酸酶去除线状载体DNA 两端的两端的5磷酸基团以尽量减少磷酸基团以尽量减少载载目的基因与克隆载体的体外重组目的基因与克隆载体的体外重组体体DNA 的自身环化或连接。的自身环化或连接。经去磷酸化的载体经去磷酸化的载体DNA 仍然可有效的与具有仍然可有效的与具有5末端磷酸的外源末端磷酸的外源DNA相连接，产生含有两个切口的环状重组相连接，产生含有两个切口

66、的环状重组DNA 分子，可直接转化并由宿主分子，可直接转化并由宿主菌菌修复切口。修复切口。这种带切口的环状这种带切口的环状DNA 的转化效率比线状的转化效率比线状DNA 高得多高得多 应含有足量的载体应含有足量的载体DNA平端连接法平端连接法 平整末端连接属于低效反应平整末端连接属于低效反应极高浓度的极高浓度的T4 噬菌体噬菌体DNA 连接酶连接酶高浓度的平整末端外源高浓度的平整末端外源DNA 和质粒和质粒DNA低浓度（低浓度（0.5 mmol/L）的）的ATP3不存在亚精胺一类的多胺不存在亚精胺一类的多胺 适量的凝聚剂适量的凝聚剂快速克隆法快速克隆法 需从纯化的凝胶中回收含目的条带的琼脂糖块，熔化后直接进行需从纯化的凝胶中回收含目的条带的琼脂糖块，熔化后直接进行质粒载体和外源质粒载体和外源DNA 的连接。的连接。同聚物加尾法同聚物加尾法 末端转移酶可催化末端转移酶可催化dNTP 加到单链或双链加到单链或双链DNA 3羟基端的能力，在羟基端的能力，在目的目的DNA 和质粒载体上加入互补同聚物，两者在通过互补同聚物之间和质粒载体上加入互补同聚物，两者在通过互补同聚物之间氢氢键形成可转化大