第九章RNA的生物合成和加工课件

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1、第九章 RNA的生物合成和加工第一节 RNA转录第二节 转录后加工第三节 RNA的复制与逆转录第四节 RNA生物合成的抑制剂第一节第一节 RNARNA转录转录转录研究的主要问题RNA聚合酶 转录过程 转录后加工 转录的调控 是基本内容，是目前研究的焦点，转录调控是基因调控的核心 转录-生物体以DNA为模板合成RNA的过程.转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止由DNA上的终止子控制，转录所需的酶叫RNA聚合酶（依赖DNA的RNA聚合酶）,转录产物：mRNA、rRNA、tRNA、小RNA.除某些病毒基因组RNA外，绝大多数RNA分子都来自DNA转

2、录的产物。一、转录：一、转录：转录单位:RNA链的转录，起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以是多个基因（原核）。转录单位的起点核苷酸为+1，起点右边为下游（转录区），转录起点左侧（5侧）为上游，用负数表示：-1，-2，-3。依此类推。相同点：1.都以DNA为模板2.原料为核苷酸，都是生成3，5磷酸二酯键3.合成方向均为53方向4.都需要依赖DNA的聚合酶 5.遵守碱基互补配对规律6.产物为多聚核苷酸链复制和转录的异同点不同点：不同点：复制复制 转录转录模板模板 两股链均作为模板两股链均作为模板 模板链作为模板模

3、板链作为模板原料原料 dNTPdNTP NTP NTP聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 RNARNA聚合酶聚合酶产物产物 子代子代DNADNA双链双链 mRNA;tRNA;rRNAmRNA;tRNA;rRNA配对配对 A-TA-T；G-C A-UG-C A-U；T-AT-A；G-CG-C引物引物 需需RNARNA引物引物 -方式方式 半保留复制半保留复制 不对称转录不对称转录 二、转录模板和酶二、转录模板和酶（一）转录模板（一）转录模板 模板链：两股DNA单链中只有一股可转录,作为模板,录成RNA的这一股DNA链称为模板链,或非编码链,反意义链，（-）链 编码链：对应的一股互补链称为非模

4、板DNA链或编码链，有意义链，（+）链,与mRNA序列相同(U-T)的DNA链。GCAGTACATGTC5533DNACGTCATGTACAG编码链模板链GCAGUACAUGUCmRNA转录Ala-Val-His-ValNC肽翻译 模板转录的不对称性特点：模板转录的不对称性特点：片段转录：即以一条DNA链一段为模板进行转录。转录可能是一个基因转录，也可能是几个基因同时转录，因时间和空间不同，转录基因有差异。DNA分子上编码链和非编码链是相对的。模板链并非永远在同一条单链上DNA上能转录出mRNA然后指导蛋白质合成的部分称为结构基因.其余的DNA可能转录(rRNA,tRNA),也可能不转录通常用

5、正链DNA的碱基序列来表示基因的一级结构.3553（二）RNA聚合酶（RNApolymerase,RNApol):RNA聚合酶特性：作用条件：4种NTP；Mg2+或Mn2+的存在；DNA模板；反应方向：53。不需引物RNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具备校对功能，因此RNA转录的保真度比DNA复制低的多。PPinnnnRNAMgDNARNAUTPnCTPnGTPnATPn)4321(/24321模板、聚合酶催化的反应：不需引物,在单核苷酸的3-OH上逐个加核苷酸。1、原核生物的RNA聚合酶 （大肠杆菌）复合体，分子量为480kD，由六个亚基组成2(全酶)，还含有两个Zn+2称为核心酶，只催化链

6、的延长，对起始无作用。亚基为启动因子不同的原核生物的核心酶相同，但亚基有所差别亚基亚基数 分子量(KD）基因功能1160rpoC与模板DNA结合1150rpoB与核苷酸结合，形成磷酸二酯键，起始和催化部位。170rpoD起始识别因子237rpoA与DNA上启动子结合19-不详E.coliE.coli RNARNA聚合酶各亚基及其功能聚合酶各亚基及其功能类 型（或A）（或B）（或C）别 名rRNA聚合酶hnRNA聚合酶小分子RNA聚合酶转 录 产 物4.5S rRNA前体hnRNA（mRNA前体）tRNA和5S rRNA，snRNA前体对a鹅膏蕈碱的繁感性不敏感抑制（高度敏感）抑制（中度敏感）2

7、、真核生物的RNA聚合酶 三种RNA聚合酶,它们专一地转录不同的基因,其转录过程和产物已各不相同.三种RNA聚合酶对鹅膏覃碱的敏感性反应不同.1、转录起始过程：A、在亚基引导下，RNA聚合酶全酶与启动子结合；B、DNA局部解开双螺旋；形成转录泡C、酶滑向转录起点，引入第一个NTP（ATP或GTP），然后与第2个NTP间形成磷酸二酯键。三、原核生物三、原核生物RNARNA的转录过程的转录过程（以（以E.coliE.coli为例）为例）转录起始 因子仅与起始有关，因子仅与起始有关，RNARNA的合成一旦开始的合成一旦开始，便被释便被释放放 E-35-10pppG或pppA55553333模板链模板

8、链+核心酶全酶(a)(b)(c)(d)的作用有点像是一把钥匙钥匙。2 2、RNARNA链的延伸链的延伸RNA合成方向合成方向5 3。速度：。速度：25-50b/s。a、合成开始后,亚基释放，然后都由核心酶催化。b、核心酶沿模板链35移动，选择NTP，暂时形成DNA-RNA杂交链。c、核心酶，DNA和新产生的RNA区域形成转录鼓泡。鼓泡前DNA不断解链，鼓泡后DNA同速复链。因为：G=CA=TA=U 故，鼓泡后DNA互补链取代杂交链中的RNA，恢复双螺旋结构。3、终止、终止 RNA聚合酶到达转录终止点时，在终止子的帮助下，聚合反应停止。RNA链和聚合酶脱离DNA模板链。转录的过程启动子结构基因终

9、止区3 3 5 5 5 pppGmRNA5 pppG5pppG5 四、启动子和转录因子 启动子：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。强启动子2秒钟启动一次转录，弱启动子10分钟一次。转录因子：RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。分析比较原核生物上百种启动子序列，发现不同的启动子都存在共有序列，启动区具有共有的序列称为保守序列或一致性序列.操纵子-35区-10区+1trptRNAlacrecAaraTyr TTTACA.N16.TATGAT.N7.A.TTTACA.N17.TATGTT.N6.A.TTGATA.N16.TA

10、TAAT.N7.A.CTGACG.N18.TACTGT.N6.A.TTGACA.N17.TTAACT.N7.A.TTGACATATAATPu(一)原核生物的启动子和转录因子启动子的结构至少由二部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；AACTGTATATTATTGACATATAAT+1转录起始点转录起始点5335 35序列序列 Sextama 框框 10序列序列Pribnow框框1、-10序列（PribnowPribnow框）框）在转录起点上游大约-10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。每个位点的

11、保守性在45%-100%。频度：T89 A89 T45 A60 A50 T96 Pribnow框是启动子的关键部位。决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物。-10序列有助于DNA局部双链解开。2、-35序列（Sextama框）在-10序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35位置，称为-35序列.频率：T82 T84G78 A65 C54A45 功能：-35序列提供RNA聚合酶识别信号.因子的初始识别位点。在很大程度上决定了启动子的强度。（二）真核启动子 RNA聚合酶(mRNA)的启动子有三个保守区：25到30有TATA框，是解链位置，并决定转录起点；失去TATA框，转录可能在许

12、多位点上开始。75位置有CAAT框（共有序列GCCAATCT），与RNA聚合酶的结合有关；上游还有GC框（序列GGGCGG），某些转录因子可结合。后两个称为上游因子，对转录起始频率有较大影响 RNApol的启动子在转录区内部(转录起点下游)。五、终止子和终止因子 终止子（terminators)terminators)：提供转录终止信号的一段DNA序列。终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。抗终止因子：有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。通读常见于某些噬菌体的时序控制。大肠杆菌有两类终止子：1.简单终

13、止子（不需因子的终止）。产物回文对称区有一段富含GC对的序列，回文后有寡聚尿苷酸UUUU（终止点前）。原核生物终止子a、发夹结构的形成：DNA上的回文序列使RNA产物3 端自身碱基互补，形成发夹结构，杂合链趋于解体。b、产物的寡聚U片段促进RNA从DNA上脱落：杂交链中A-U间氢键相对较弱，新生RNA易从模板上脱落，不需因子即可终止。不需因子的终止2.依赖因子终止的终止子。必须在有因子时才能发挥作用，终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。因子是一个6聚体蛋白，其功能：1）终止因子；2）NTPase活性，3）解旋酶活性。终止过程：1）在RNA存在下，水解NTP产能，使因子与 RNApol结

14、合；2）解旋酶活性使RNA：DNA杂合链拆开，释放RNA，酶和因子一起从DNA上脱落下来。需因子终止第二节、RNA的转录后加工u转录后加工转录后加工转录生成的转录生成的RNARNA，称初级转录产物（前，称初级转录产物（前RNARNA，RNARNA前体）前体）无论式原核生物或真核生物，初级转录产物都必须经过一无论式原核生物或真核生物，初级转录产物都必须经过一定的加工、修饰才能表现其生物学功能，此过程称为转录后定的加工、修饰才能表现其生物学功能，此过程称为转录后加工加工u原核生物转录后加工相对简单原核生物转录后加工相对简单原核生物的原核生物的mRNAmRNA通常是边转录边翻译，一般不进行加工修通常

15、是边转录边翻译，一般不进行加工修饰饰稳定的稳定的tRNAtRNA和和rRNArRNA常经过一系列的加工才成为活性分子常经过一系列的加工才成为活性分子u真核生物转录后加工较复杂真核生物转录后加工较复杂 大肠杆菌有7个rRNA的转录单位，它们分散在基因组的各处。每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA以及若干个tRNA基因所组成。一、原核生物中一、原核生物中RNARNA的加工的加工1 1、原核、原核rRNArRNA前体的加工前体的加工l刚转录的rRNA为30S，先在特定的碱基上或核糖进行甲基化（核糖2-甲基）修饰；l后逐步裂解（核酸内切酶RNAase的切割）产生核糖体RNA的前体

16、P16和P23，P5由RNAaseE作用产生；l再由相应核酸酶切除附加序列。原核原核rRNArRNA前体的加工步骤：前体的加工步骤：P16P16P23P23P5P516S16S23S23S5S5S（一般不含甲基化）（一般不含甲基化）rRNArRNA原初原初转录物转录物30s30srRNA和几个tRNA16s,23s,5sP16,P2330s专一核酸酶切割核酸酶裂解甲基化tRNA基因不止一个拷贝。tRNA基因大多成簇存在，或与rRNA基因，或与蛋白质基因组成混合转录单位。ltRNAtRNA前体加工步骤前体加工步骤：（1）由核酸内切酶(RNaseP、RNaseF)切断tRNA前体上5 和3端两端；

17、（2）由核酸外切酶(RNaseD)逐个在3切去附加序列，进行修剪。（3）3端添加CCAOH序列（某些tRNA已有，由核苷酰转移酶催化，接受活化AA所需）（4）核苷的特定修饰（修饰酶）：包括碱基甲基化（一般由S-腺苷蛋氨酸（SAM）提供）和假尿苷修饰 2 2、tRNAtRNA前体的加工：前体的加工：tRNA前体5353RNaseFRNasePRNasePRNaseD加加工工53tRNACCA 由单顺反子构成mRNA，一般不需加工，一经转录，即可直接进行翻译。有些原核生物多顺反子构成的mRNA，须由核酸内切酶切成较小的mRNA，然后再进行翻译。3、mRNA前体的加工：5 3 顺反子顺反子顺反子顺反

18、子顺反子顺反子插入顺序插入顺序插入顺序插入顺序先导区先导区末端顺序末端顺序AGGAGGUSD区区二、真核生物RNA的加工1 1、真核真核rRNArRNA前体的加工前体的加工真核生物核糖体的小亚基含：16-18S rRNA，大亚基含：26-28S、5S、5.8S rRNA（特有）。真核rRNA基因成簇排列在一起，18S、5.8S、28S rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。5S rRNA基因也成簇排列，间隔区不被转录，由RNA聚合酶转录后经适当加工，参与构成大亚基真核细胞的rRNA基因称为高度重复序列。真核细胞的rRNA基因的高度重复序列

19、。18s5.8s28s18s-rRNA5.8s和28s-rRNA真核rRNA前体的加工过程：甲基化(主要在核糖2-羟基，比原核生物甲基化程度高)剪切(RNA酶等核酸内切酶)18s5.8s28s5stRNA18s5.8s28s45S前体前体18s5.8s28s18s5.8s28s甲基化甲基化核酸内切酶核酸内切酶rRNA2 2、真核真核tRNAtRNA前体的加工：前体的加工：真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA基因由RNA聚合酶转录。真核tRNA前体的加工过程与原核相似。但3端的CCA都是后加的，除碱基修饰外，还有核糖修饰（2-O-甲基

20、核糖）。mRNA的原初转录产物是分子量很大的前体，在核内加工时形成大小不等的中间物，称为核内不均一RNA(hnRNA)。其中，约有25%可转变成成熟的mRNA。hnRNA转变成mRNA的加工过程主要包括：a.5末端形成帽子结构b.3末端切断并加上polyAc.甲基化d.剪接除去内含子对应的序列，拼接外显子3、真核mRNA的前体加工（1）5端加帽子：5帽子在转录前已经形成。5帽子起识别和保护功能 有三种类型的帽子：CAP O型，CAP型，CAP型。磷酸酶pppG鸟苷酸转移酶SAM甲基转移酶pppN1pN2p5ppN1pN2ppi5+G pppN1pN2p5+ppim7GpppN1pN2P5CAP

21、 O型帽子（2）3端加尾 加尾信号：在靠近3端区有一段非常保守的序列AAUAAA，作为加尾信号。早在核内完成 由RNAase在3端加尾信号后1130位置切断，然后由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上20200AAAAAAA（polyA）。polyA的功能a.防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解，起缓冲作用。b.与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。（3）、内部甲基化 某些真核mRNA内部有甲基化的位点，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。在hnRNA中已经存在。可能对前体的加工起识别作用。5 “帽子帽子”PolyA 3 顺反子顺反子m7G-5 ppp-N-3 pAAAAAAA-OH（4 4）mRNAm

22、RNA的切割拼接的切割拼接4、RNA的拼接（内含子的去除）多数真核基因是断裂基因，其转录产物通过拼接，去除内含子，使编码区（外显子）成为连续序列。内含子结构多样，拼接机制多样：有些内含子可以催化自身的拼接（核酶）,有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。反式拼接构成拼接体完成拼接(1)、tRNA的拼接 酵母tRNA约有400个基因，有内含子的基因约占1/10，内含子长度14-46bp，没有保守性。切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构，而不是什么保守序列。拼接过程：第一步切除内含子，不需ATP；第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接，需要ATP。外显子外显子外显子外显子内含子内含子HOH

23、OP32P32PAPPP32OHP32PATPADP激酶连接酶(2)、四膜虫rRNA的拼接 某些四膜虫26SrRNA基因中有一个内含子，其拼接只需一价和二价阳离子及鸟苷酸或鸟苷存在即可自发进行。其实质是磷酸酯的转移反应，鸟苷酸起辅助因子的作用，提供游离3羟基。发现核酶：具有催化活性的RNA 线性rRNA具有许多反向互补序列，可形成局部双螺旋。外 显 子外 显 子1内含子内含子A64G73 G100T100A62A68G84T63 6Py74-84NC65A100G100 N外 显 子外 显 子2 真核生物所有编码蛋白质的核结构基因，其内含子的左端均为GT，右端均为AG。此规律称GT-AG规律（

24、对于mRNA就是GU-AG规律，此规律不适合于线粒体、叶绿体的内含子，也不适合于tRNA和某些rRNA的核结构基因）(3)、真核生物mRNA前体的拼接拼接过程：拼接体形成：U系列snRNA通常都与多肽或蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒（RNP），其5端序列与内含子拼接处互补，参与拼接过程 先在内含子的左端切开，产生的5末端与3端上游的A形成5,2-磷酸二酯键，构成套索结构，释放外显子1。外显子1的3-OH亲核攻击外显子2的5-P，两个外显子连接起来形成磷酸二酯键，释放套索。拼接体形成拼接体形成m7GpppAAAnA-OHm7GpppAAAnA-OHm7GpppAAAnA-OH内含子核浆胞浆mRNA

25、前身能翻译的mRNA外显子1外显子2RNA剪接转运第三节、第三节、RNARNA的复制的复制与逆转录 许多病毒和噬菌体以RNA为遗传物质，称为RNA病毒 病毒RNA复制酶具有很高的模板专一性，只识别病毒自身的RNA。它以病毒RNA为模板，合成与模板性质相同的RNA一、噬菌体QRNA的复制5 RNA-5 3 3 RNA+释放释放释放释放35 3 3 5 5 RNA+RNA+RNA-vRNARNA-及及 RNARNA+的合成方向均为的合成方向均为5 35 3正链RNA病毒（mRNA）：如噬菌体Q及灰质炎病毒。负链RNA病毒(带复制酶)：如狂犬病毒。双链RNA病毒（带复制酶）：如呼肠孤病毒。反转录RN

26、A病毒：如白血病病毒和肉瘤病毒。2、病毒RNA复制的主要方式病毒)RNA)RNA/(Pr复制酸)RNA()RNA)RNA/(Cell复制酶)RNA(病毒Pr复制酶)RNA)RNA/()RNA(Cell复制酶双链RNA RNA病毒RNARNA/RNARNA/复制E和相关蛋白CellRNA合成 3、RNA的反转录（逆转录）：概念：以RNA为模板，4种dNTP为底物，逆转录E催化，合成与模板互补的DNA(cDNA)的过程。这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称。逆转录酶：性质：（1）RNA指导的DNA聚合酶活力：以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNADNA杂种分子。（2

27、）RNase H酶活力：水解RNADNA杂种分子中的RNA，可沿35和53两个方向起外切酶作用。（3）DNA指导的DNA聚合酶活力。需模板：RNA或DNA，短链RNA引物，dNTP为底物RNA模板杂化双链单链DNA双链DNA反转录酶RNaseH碱水解DNA聚合酶整合S1核酸酶细胞内复制试管内合成反转录酶反转录酶RNA（+）RNA（+）/cDNA（-）DNA（+）/cDNA（-）RNA（+）逆转录过程逆转录过程第四节、第四节、RNARNA生物合成的抑制剂生物合成的抑制剂1、嘌呤和嘧啶类似物：人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。如NNNHNNH2NH2SH作为代谢拮抗物抑制合成酶类或直接

28、掺到核酸分子中，形成异常RNA或DNA。NNNHNNH2NH2NNNHNNH2NH2OHNNHNHOOFNNNHNNH2NH2SH2、DNA模板功能的抑制物：（1）烷化剂：使DNA发生烷基化，发生在G-N7，A-N1、N3 N7；C-N1。易引起嘌呤的水解脱落，在DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。（2）放线菌素：可与DNA形成非共价复合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素（3）嵌入染料：可插入双链DNA分子相邻的碱基对之间，一般具有芳香族发色团。溴化乙锭（EB）是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测DNA和RNA。与DNA结合后抑制其复制和转录。一些化合物可以与DNA模板结合，抑制其复制和转录3、RNA聚合酶抑制物（1）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。在体外有抗病毒作用。（2）利链霉素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。（3）-鹅膏蕈碱：主要抑制真核RNA聚合酶和活性，对细菌的RNA聚合酶作用极小。本章重点本章重点模板链、编码链、不对称转录的概念。转录和复制的异同启动子、终止子概念。大肠杆菌两类转录终止的方式真核生物mRNA、tRNA及rRNA转录后加工的主要方式。