胶原样凝集素幻灯

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1、胶原样凝集素COLLECTIN郑州大学医学院免疫学与微生物学教研室李付广一、凝集素（LECTIN）的分类 C-型凝集素:需要Ca2+维持活性的凝集素 S-型凝集素:巯基依赖或-半乳糖结合的凝集素二、胶原样凝集素历史上的重要发现 1906 conglutinin;first animal lectin to be associated with the immune system 1989-1991 mannan-binding lectin 1999 collectin liver 1(CL-L1)2001 collectin placenta 1(CL-P1)2003 collectin k

2、idney 1(CL-K1)三、胶原样凝集素的一般特性四、胶原样凝集素的结构（一）一级结构特点 1.N端富含半胱氨酸区段：7-28氨基酸，其中1-3半胱氨酸 2.胶原样区：53-177氨基酸(-Gly-Xaa-Yaa-)n重复序列,Xaa、Yaa多为脯aa或羟脯aa 3.颈区：24-28氨基酸，-helice coiled-coils 4.糖识别区（CRDs）：与相应的糖配体结合(二)三级结构1.同源三聚体的形成(亚单位)相同的三条肽链形成类似郁金香花朵2.亚单位进一步聚集成寡聚体 单体-CL-43,CL-L1 四聚体-SP-D,Conglutinin,CL-46(十字形结构)六聚体-SP-A

3、,MBL(一束郁金香花)(三)糖结合特异性 胶原样凝集素的凝集素样活性存在于CRDs,由三个氨基酸基序决定:1.甘露糖结合基序:Glu-Pro-Asn 2.半乳糖结合基序:Gln-Pro-Asp 所有胶原凝样集素(SP-A除外)均具有甘露糖特异基序Glu-Pro-Asn,SP-A第三位的氨基酸由Arg(狗)或Ala替换Asn.系统树(五)结合微生物种类五、胶原样凝集素在宿主防御方面的生物学功能（一）凝集作用 通过桥联，可使病原微生物凝集成大块，加强呼吸道黏膜纤毛清除作用，阻止病原吸附到细胞表面，抑制其定居和侵入，促进吞噬作用。（二）补体激活作用 1.MBL产生 病原微生物感染早期 刺激激活 巨

4、噬细胞和中性粒细胞 TNF-,IL-1,IL-6 急性期反应 肝细胞 MBL,CRP 2.MBL途径(lectin pathway)MBL与病原微生物表面的mannose,fucose,GlcNAc结合启动的补体激活级联反应 (三)调理作用 1.collectin的受体 见下表 2.collectin直接作为调理素 3.激活补体成分 C4b,C3b,iC3b 4.吞噬作用的激活(四)抑制微生物的生长 SP-A,SP-D直接引起微生物细胞壁通透性增强,导致微生物生长抑制或死亡(五)调节炎症反应 调节前炎症因子的合成分泌(六)调节特异性免疫 DCs抗原提呈,DCs成熟,T细胞增殖(七)调节过敏反应

5、 SP-A,SP-D抑制IgE与过敏原结合,抑制过敏早期组织胺释放,抑制晚期支气管炎症中淋巴细胞增殖(八)对细胞凋亡的影响 SP-A抑制型肺泡细胞凋亡,SP-A、SP-D,、MBL刺激凋亡细胞清除Human CL-L1的研究 1999年Ohtani k.等克隆和鉴定出一个编码新的胶原凝集素基因，称肝脏胶原凝集素1（collectin liver 1，CL-L1），该基因定位于第八号染色体的长臂上，其基因结构由6个外显子（EX1EX6）和5个内含子（IN1IN5）组成，cDNA含有831bp插入片段，编码277个氨基酸残基。推测的氨基酸序列具有典型的胶原凝集素结构：N端富含半胱氨酸区、胶原样区、

6、颈部和糖识别区。CL-L1与其他胶原凝集素相比，具有独特之处，MBL、SP-A和SP-D基因定位于第10号染色体，而CL-L1基因定位于第8号染色体，C末端具有4个重复的赖氨酸结构，CRD和颈区由一个外显子编码，胶原样区有5个外显子编码。胶原凝集素绝大多数为分泌型，存在于体液和分泌液中，只有CL-L1为可溶性胞浆内蛋白，因此推测CL-L1可能具有独特的功能。Comparison of three constructsConstructsMax.O.D.SolubilityIPTG inductionLeakage2GXY+NECK+CRD0.8no(PBS)yesyesNECK+CRD kkk

7、k1part(TBS),no(PBS)noyes2GXY+NECK+CRDkkkk1nonoyesNeck+CRDkkkk M 1 2 3 425kDa17kDaM marker1 before induction2 induction 1 hr3 induction 3 hrs4 induction 5 hrsCBB stainingGrowth of standard E.coli expression culture(200 ml)(1)Inoculate 20 ml of SOB(containing ampicillin 100g/ml,chloramphenicol 35g/ml)

8、in 100 ml flask.Grow the cultures overnight at 37 C.(2)Inoculate 200 ml of prewarmed SOB media with 10 ml of the overnight cultures and grow at 37 C with vigorous shaking until an OD600 of 0.6 is reached.(3)Take a 1 ml sample immediately before induction.(4)Induce expression by adding IPTG to a fina

9、l concentration 1 mM.(5)Incubate the cultures for 3 hrs.Collect a second 1 ml sample.(6)Harvest the cells by centrifugation at 3500rpm for 25 min.(7)Freeze the cells at-70.Preparation of cleared E.coli lysate under denaturing conditions(1)Thaw the cell pellet for 15 min on ice and resuspend in lysis

10、 buffer at 5 ml per gram wet weight.(2)Stir cells for 15-60 min at room temperature.(3)Centrifuge lysate at 10000g for 20-30 min at room temperature to pellet the cellular debris.Save supernatant,and filter the supernatant with 0.45 m filter.(4)Add 10 l 2SDS-PAGE sample buffer to 10 l supernatant an

11、d store at-20 C for SDS-PAGE analysis.Purification of Neck+CRD KKKK of hCL-L1 with Ni-NTA column(1)Equilibrate column with 5 column volumes of lysis buffer.(2)Apply lysate to column.Collect the pass-through for SDS-PAGE analysis(recycle once).(3)Wash with 10 column volumes of wash buffer until A280

12、is below 0.01.(4)Elute protein with elution buffer.Collect the single protein peak completely.Dialysis of recombinant protein buffer 1-8M ureaTBS(pH7.6)/300ml;buffer 2-TBS(pH7.6)/3000ml(1)Add elution into membrane tube(MWCO15000),put the membrane in 300 ml buffer 1,stirring slowly.(2)Add 100 ml buffer 2 at 6 hour intervals,total 8 times.(3)At last put membrane in 2000 ml buffer 2 for dialysis overnight.1 2 3 4M25kDa16.5kDaM marker1,3 before induction2,4 induction 3hrsCBB staining1 2 3 4 5 3 4 5MM marker1 pre-sample2 pass3 elution4 sup5 ppt25kDa16.5kDaCBB staining W.B免疫兔子获得免疫血清 谢谢谢谢!