AKTA层析分离技术蛋白分离PROTEIN

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1、1层析分离纯化技术层析分离纯化技术2010.11.28 Shanghai Pudong2蛋白质纯化策略蛋白质纯化策略融合蛋白质融合蛋白质非融合蛋白质非融合蛋白质表达表达简单纯化简单纯化一步一步 亲和层析亲和层析90-97%纯度纯度更高纯度更高纯度三步纯化策略三步纯化策略粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化多步纯化多步纯化3简易纯化选择简易纯化选择载体和标记载体和标记纯化纯化pGEX谷胱甘肽 S-转移酶 GST MicroSpin Purification Module,GSTrap,Glutathione Sepharose Fast FlowPQE6 x 组氨酸His MicroSpin

2、 Purification ModulepETHisTrap,HiTrap Chelating,6 x组氨酸Chelating Sepharose Fast FlowpEZZ 18(非诱导性表达)蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast FlowpRIT2T(利用温度改变诱导)蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast Flow4GST 融合蛋白的纯化融合蛋白的纯化GST重组蛋白重组蛋白 酶切位点酶切位点Factor Xa:Mr 17-20 000/28-30 000Thrombin:Mr r 37 000PreScission Pro

3、tease:Mr r 46 000Glutathione Sepharose Mr 26 00010C5任何规模纯化都比较简单任何规模纯化都比较简单预装柱预装柱/填料填料一次可纯化一次可纯化 GST注意注意融合蛋白的量融合蛋白的量GST MicroSpin 400 g立即可用,预装柱,Purification Module 缓冲液和试剂和 MicroPlex 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量(一次处理 48 样品)GSTrap 1 ml10-12 mg立即可用,预装柱GSTrap 5 ml50-60 mg立即可用,预装柱Glutathione Sepharose 4B8 mg/m

4、l可自行装柱Glutathione Sepharose 410-12 mg/ml可自行装柱，使用层析系统快速纯化，Fast Flow 适合放大6GST MicroSpin Purification Module 立即可用立即可用,50 预装柱含缓冲预装柱含缓冲液和所需试剂液和所需试剂 可纯化每柱可纯化每柱 400 g,体积达体积达400 l 样品样品适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化7GSTrap 柱柱 20 分钟内分钟内 每每 1 ml 柱柱 12 mg 或或 每每 5 ml 柱柱 60 mg 使用针筒，蠕动泵，或者使用针筒，蠕动泵，或者 KTA

5、 系统系统 添加剂兼容添加剂兼容适合快速和重复性高的要求适合快速和重复性高的要求8GSTrap结合缓冲液平衡加样后用结合缓冲液冲洗 废液收集用洗脱缓冲液洗脱收集组份3 min5-15 min2 min9GSTrapSDS PAGE analysis020406080100%Elution buffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0ml minWashElutionbuffer2.7 mg pure GST fusion protein5.010.015.020.0A280kD9414.420.13043671 2 3柱柱:GSTrap 1 ml样品样

6、品:8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液结合缓冲液结合缓冲液:PBS,pH 7.3洗脱缓冲液洗脱缓冲液50 mM Tris-HCl,pH 8.0 10 mM 还原谷胱甘肽流速流速:1 ml/min层析层析 步骤步骤:4 CV结合缓冲液,8 ml 样品,10 CV结合缓冲液,5 CV洗脱缓冲液,5 CV结合缓冲液(CV=柱体积)系统系统:KTAexplorer 101:低分子量标记(LMW)Calibration kit,还原,Amersham Pharmacia Biotech2:胞浆萃取液,1 g/10 ml3:洗脱GST 融合蛋白10Glutathione Sepharos

7、e Fast Flow适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用，适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用，并用作放大并用作放大 每毫升填料可以纯化每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白融合蛋白 装在装在 XK 空柱中和空柱中和 KTA 平台纯化平台纯化系统连接使用系统连接使用 高流速高流速 兼容尿素，盐酸胍等兼容尿素，盐酸胍等11GST 融合蛋白的检测融合蛋白的检测检测方法检测方法注意注意GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒适合筛选表达系统和层析组份当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别有用GST 酶测定检测模组快速测定；适合筛选用途 功能测定可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋

8、白的活性，但可能需要自行设计和优化12GST融合蛋白的检测融合蛋白的检测检测方法检测方法注意注意使用抗-GST 抗体和高度特异,只检测 GST 融合蛋白ECL 检测系统的使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和%纯度讯息.考马氏染色或银染 可检测融合蛋白和污染物.13GST 96-孔板孔板 ELISA 检测试剂盒检测试剂盒 快速酶测定快速酶测定 每块板可检测每块板可检测 50 样品样品 适

9、合筛选表达系统和层析组适合筛选表达系统和层析组份份14(His)6 融合蛋白的纯化和检测融合蛋白的纯化和检测重组蛋白重组蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+15任何规模纯化都比较简单任何规模纯化都比较简单预装柱预装柱/填料填料一次可纯化一次可纯化 注意注意融合蛋白的量融合蛋白的量His MicroSpin 100 g立即可用,预装柱,Purification Module 缓冲液和试剂和 MicroPlex 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量(一次处理 48 样品)HiTrap Chelating 1 ml 12 mg立即可用,预装柱His

10、Trap Kit 12 mg/柱含预装柱和足够 12 纯化的缓冲液HiTrap Chelating 5 ml 60 mg立即可用,预装柱Chelating Sepharose Fast Flow 12 mg/ml 自行装填到空柱和放大用 16His MicroSpin 纯化模组纯化模组 立即可用立即可用,50 预装柱连缓冲液预装柱连缓冲液和试剂和试剂 每柱可纯化达每柱可纯化达 100 g,体积达体积达 400 l 样品样品适合蛋白质扩增系统的筛选和优化，小规模纯化适合蛋白质扩增系统的筛选和优化，小规模纯化17HisTrap Kit 每根每根 HiTrap Chelating 金属螯合柱金属螯合

11、柱可在少於可在少於 25 分钟中纯化分钟中纯化 12 mg 融合蛋融合蛋白白 包含所需浓缩缓冲液和工具包含所需浓缩缓冲液和工具 使用针筒，蠕动泵，或者使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统系统 添加剂兼容添加剂兼容快速，重复性好和容易使用快速，重复性好和容易使用18HiTrap Chelating准备柱子 用 H2O 洗加 NiSO4 再用 H2O 洗加样用平衡缓冲液冲洗柱子废液收集用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白收集组份3 min5-15 min2 min用平衡缓冲液平衡柱子废液3 min19HiTrap ChelatingSDS PAGEFlow through加样结合液洗脱液结合液AA280280

12、AA4054051.00.50.00.700.600.500.400.300.200.100.05.010.015.020.0Volume(ml)ElutedpoolW ashkDa94.067.043.020.114,41 2 3 4 5 6 7 8样品样品:5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶，GST-(His)6柱柱:HiTrap Chelating 1 ml,加 Ni2+结合缓冲液结合缓冲液:1X 磷酸缓冲液,20 mM 咪唑 pH 7.4洗脱缓冲液洗脱缓冲液:1X 磷酸缓冲液,500 mM咪唑 pH 7.4流速流速:2 ml/min,312 cm/h结果结果:洗脱 G

13、ST-(His)6,4 ml,A280:1.65 总量:4.46 mg1:低分子量标记(LMW)2:样品稀释 1:203:穿透稀释 1:104:冲洗液5:洗脱 GST-(His)6,稀释 1:206:洗脱 GST-(His)6,稀释 1:107:GST 标准品,0.5 mg/ml8:LMW20Chelating Sepharose Fast Flow适合自行装柱和放大适合自行装柱和放大 每毫升填料可纯化高达每毫升填料可纯化高达 12 mg 融合蛋白融合蛋白 装在装在 XK 空柱中和空柱中和 KTA 平台纯化系统平台纯化系统连接使用连接使用 高流速高流速 兼容添加剂兼容添加剂21检测检测(His

14、)6 融合蛋白融合蛋白检测方法检测方法注意注意ELISA 测定标记 IgG高特异性，只检测(His)6 融合蛋白功能测定可有效评估纯化出来的(His)6 融合蛋白是否具备活性 不一定能买到可能需要自行设计和优化22检测检测(His)6 融合蛋白融合蛋白检测方法检测方法注意注意使用抗-His 抗体和高度特异,只检测(His)6 融合蛋白ECL 检测系统的使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏度需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和

15、%纯度讯息.考马氏染色或银染 可检测融合蛋白和污染物.23其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的纯化非融合蛋白的纯化(1/3)如果有对应配基，使用亲和层析如果有对应配基，使用亲和层析-一步纯化一步纯化-高灵敏度高灵敏度-高载量高载量24其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的纯化非融合蛋白的纯化(2/3)立即可用的 HiTrap 柱应用应用 预装柱预装柱抗体分离抗体分离 所有来源的 IgG，其亚族，和片断 HiTrap Protein A 和 HiTrap rProtein A包括人源IgG3，小鼠 IgG1和大鼠 IgGHiTrap Protein G的 IgG，其亚族，和片断 腹水，血请，体液，

16、和细胞培养液的 MAbTrap GII(HiTrap Protein G column(1 ml),单克隆和多克隆 IgG 工具,浓缩缓冲液)鸡蛋请的 IgY HiTrap IgY 单克隆和人源 IgMHiTrap IgM25其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的纯化非融合蛋白的纯化(3/3)立即可用的 HiTrap 柱应用：应用：基团特异填料基团特异填料 预装柱预装柱白蛋百,多种核酸依赖酶,HiTrap Blue 凝血因子,DNA 结合蛋白,a2-巨球蛋白外露氨基酸:His(Cys,Trp)HiTrap Chelating的蛋白和多肽 e.g.a2-巨球蛋白和干扰素生物素和含生物素物质HiTr

17、ap Streptavidin凝血因子,脂蛋白酶，HiTrap Heparin胆固醇受体,激素,DNA结合蛋白,干扰素,蛋白质合成因子活化好的亲和柱自行挂上配基活化好的亲和柱自行挂上配基 HiTrap NHS-activated偶连一级氨基26其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的纯化非融合蛋白的纯化 准备配基准备配基(e.g.抗体抗体)准备柱子准备柱子(e.g.NHS-activated HiTrap)现成方法现成方法 优化结合和洗脱条件优化结合和洗脱条件 使用针筒，蠕动泵，或者使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统操作的系统操作的 HiTrap 小柱小柱制作一支特异亲和纯化柱制作一支特异亲和纯

18、化柱27其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的检测非融合蛋白的检测生物活性生物活性Native PAGEIEFMS分子大小蛋白质酶切SDS-PAGE免疫印迹免疫印迹MS N-端测序端测序聚合物差异性pH 稳定性,离子强度,蛋白质和 清洁剂浓度结构变异N-端差异28去处小分子去处小分子 纯化后纯化后(His)6 融合蛋白的咪唑融合蛋白的咪唑 酶切后的酶切后的 GST 或或 His 标记标记 多余的盐多余的盐/尿素尿素/盐酸胍盐酸胍 用用 HiTrap Desalting 将样品转移到另一种缓冲液中将样品转移到另一种缓冲液中，e.g.储存用或改变储存用或改变 pH29交换缓冲液和去盐的柱子交换缓冲液

19、和去盐的柱子 快速有效快速有效 高处理量高处理量 去盐去盐,交换缓冲液交换缓冲液,去掉低分子量物质去掉低分子量物质柱子柱子样品体积样品体积样品洗脱体积样品洗脱体积MicroSpin G-25 0.1-0.15 ml0.1-0.15 mlHiTrap Desalting0.25-1.5 ml1.0-2.0 mlHiPrep 26/10 Desalting2.5-15 ml7.5-20 ml30交换缓冲液和去盐的柱子交换缓冲液和去盐的柱子HiTrap Desalting咪唑在盐峰中一并被去除咪唑在盐峰中一并被去除00.050.100.15AU280nm UV 280 nm 电导(His)融合蛋白盐

20、峰6注射(His)6 融合蛋白融合蛋白31选择纯化设备选择纯化设备纯化需要纯化需要MicroSpinSyringe+KTA 系统系统+PurificationHiTrap HiTrap Modulescolumnscolumns快速，高处理量筛选(GST or(His)6 融合蛋白)非常快速，一步纯化 (适合大部分融合蛋白)一步纯化 (适合大部分融合蛋白)优化以提高纯度 常规实验，重复性好 纯化后蛋白复性 32选择纯化设备选择纯化设备 多步纯化多步纯化(非融合性蛋白或需要更高纯度非融合性蛋白或需要更高纯度)工艺开发和优化工艺开发和优化 法规需要法规需要 e.g.GLP/GMP 纯化工艺放大纯化

21、工艺放大 转移工艺到更大规模转移工艺到更大规模使用使用 KTAFPLC 或或 KTAexplorer 系统系统:33大肠杆菌包涵体表达大肠杆菌包涵体表达(His)6 融合蛋白的融合蛋白的扩增，纯化和复性扩增，纯化和复性详细步骤详细步骤34过程过程细胞培养细胞培养收获细胞收获细胞细胞破碎细胞破碎离心离心5-10 000g沉淀物沉淀物冲洗和离心冲洗和离心分离包涵体分离包涵体HiTrap Chelating Ni2+纯化和复性纯化和复性溶解溶解35 每每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀培养液重新悬浮细胞沉淀物於物於 4 ml 20 mM Tris-HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡

22、破碎细在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在胞，并在+4C下高速离心下高速离心 10 分钟分钟 重新悬浮细胞沉淀物於重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含含 e.g.urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡的冲洗缓冲液和再度超声震荡 并在并在+4C下高速离心下高速离心 10 分钟分钟 用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物包涵体包涵体-细胞破碎细胞破碎,冲洗和分离冲洗和分离2 M UREA20 mM Tris HCl2%Triton X1000.5 M NaCl36溶解和准备样品溶解和准备样品 重新悬浮细胞沉淀物於重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶解缓冲液溶解缓冲液(e.g.):20 m

23、M Tris-HCl,0.5 M NaCl,5 mM 咪唑,6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇巯基乙醇pH 8在室温等 30-60 分钟在+4C 离心 15 分钟用 0.22 m 或 0.45 m 濾膜过滤37准备准备 HiTrap Chelating 柱柱 冲洗冲洗 5 ml H2O 加加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 冲洗冲洗 5 ml H2O 用用 5-10 ml 20 mM Tris-HCl,5 mM 咪唑咪唑,6 M 盐酸胍盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇巯基乙醇pH 8 结合缓冲液洗柱结合缓冲液洗柱最最多多 5 分钟分钟38纯化和复性纯化和复性稀释样品,用 10 ml 结

24、合缓冲液洗柱，5 mM 咪唑,6 M 盐酸胍,pH 8.0上样，并以 20 mM咪唑,6 M 尿素 pH 8.0 缓冲液洗柱线性梯度：6 to 0 M 尿素 最少 30 柱体积流速：0.1 ml/min-1 ml/min用没有尿素缓冲液冲洗 5 个柱体积线性梯度:20 mM-500 mM 咪唑10-20柱体积用 HiTrap Desalting 交换缓冲液去除咪唑1.00.750.50.250102030 40506065mlManually using a syringe:Sample loading Gua-HCl wash Urea wash Startelutionfr.38fr.42

25、fr.46fr.49fr.40Start refold-ingA28039组份分析组份分析1:LMW2:样品3-6:盐酸胍冲洗物7,8:尿素冲洗物1:LMW2-6:组份 38-427,8:组份 48,491.00.750.50.2505101520mlA280kD9467433020.114.412345678kD9467433020.114.412345678Superdex 75 HR 10/30SDS PAGE PhastGel Gradient 1015样品稀释前处理样品稀释前处理:用 15%SDS,30%2-巯基乙醇+10 mM Tris+1 mM EDTA稀释1:5HiTrap C

26、helating 1 mlSuperdex 75 HR 10/3040多维蛋白质纯化多维蛋白质纯化41高效纯化策略高效纯化策略载量载量速度速度分辩率分辩率回收率回收率42减少处理步骤减少处理步骤得率(%)95%/步90%/步85%/步80%/步75%/步02040608010012345678步骤43准备工作准备工作 考虑考虑:纯度水平纯度水平 需要量需要量 保持生物活性保持生物活性 有效和经济有效和经济 蛋白质特性蛋白质特性:稳定性稳定性-pH-离子强度离子强度-温度温度 分子量分子量 等电点等电点44pH 的重要性的重要性:蛋白质净电荷随蛋白质净电荷随 pH 改变改变滴定曲线蛋白质净电荷蛋

27、白质净电荷 1210稳定性范围用阳离子交换用阳离子交换用阴离子交换用阴离子交换3pH不同 pH 下的分离情况21+-45pH 的重要性的重要性:蛋白质净电荷随蛋白质净电荷随 pH 改变改变流动相的流动相的 pH 选择性选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷Abs Abs Abs Abs46样品准备样品准备考虑考虑:根据蛋白质来源选择不同萃取方法根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理在室温以下快速处理 用缓冲液维持用缓冲液维持 pH,离子强度离子强度目的目的:稳定样品稳定样品

28、47三步纯化策略三步纯化策略Step 纯度粗提粗提 中度纯化中度纯化 精细纯化精细纯化 样品准备样品准备,萃取萃取,净化净化 达到最高纯度达到最高纯度去除大部分杂质去除大部分杂质 分离分离,浓缩浓缩和稳定样品和稳定样品48三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤层析填料的层析填料的颗粒大小颗粒大小49三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤流速流速50三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤分辩率分辩率51粗提粗提目的目的 纯化粗样纯化粗样 快速浓缩快速浓缩(减少体积减少体积)和稳定样品和稳定样品(去除蛋白去除蛋白酶酶)最适用层析技术最适用层析技术:离子交换离子交换/疏水层析疏水层析分辩率快速快速回收率载量载量52粗

29、提粗提:离子交换填料离子交换填料预装柱预装柱 20ml颗粒大小颗粒大小流速流速HiPrep 16/10 Q XL&SP XL 90 m 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE&CM 90 m 10 ml/minSepharose Big BeadsSTREAMLINESepharose Fast Flow53粗提粗提:疏水层析填料疏水层析填料 高载量高载量 高流速高流速HiPrep 16/10 Phenyl(高&低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 OctylHiTrapHIC 选择试剂盒放大54中度纯化中度纯化目的目的 去除大部分杂质去除大部分杂

30、质最适用层析技术最适用层析技术:离子交换离子交换/疏水层析疏水层析HiLoad离子交换和疏水层析预装柱分辩率分辩率快速回收率载量载量55中度纯化中度纯化:离子交换填料离子交换填料Sepharose HP 34 mQ&SP150 cm/hr小包装和预装柱小包装和预装柱 交联琼脂醣交联琼脂醣SOURCE 30 mSepharose High PerformanceSOURCE 30 Q&S 25 mg 上样载量上样载量3 m:Mini Q&SMini Beads Q&S 2 mg上样载量上样载量61精细纯化精细纯化:离子交换和疏水层析填料离子交换和疏水层析填料RESOURCE15 mQ,S,Phe

31、nyl,Ether,Isopropyl1 ml 预装柱流速高达预装柱流速高达10 ml/min RESOURCE HIC Test Kit62精细纯化精细纯化:反相层析填料反相层析填料SephasilRPC硅胶硅胶3 mC2/C18聚苯乙烯聚苯乙烯/二乙烯基苯二乙烯基苯120:肽类肽类C4,C8,C185 and 12 m硅胶硅胶100:肽类肽类300 :蛋白质蛋白质pH 1-12(14)肽类肽类5,15 and 30 m63Source30 m15 m5 m离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析64适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术蛋白质性质蛋白质性质层

32、析技术层析技术净电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水层析(HIC),反相层析(RPC)生物辩识(配基特异性)亲和层析(AC)配基特异性，净电荷,扩张柱床吸附技术(EBA)疏水性有AC,IEX or HIC65适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术层析技术层析技术主要特色主要特色粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率66适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术层析技术层析技术样品起始状态样品起始状态样品结束状态样品结束状态IEX低离子强度高离子强度

33、或 pH 改变样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩HIC高离子强度低离子强度样品被浓缩样品被浓缩AC特异性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩GF样品体积受限制交换缓冲液(2 M(NH4)2SO4容易氧化78DAOCS-一般准则一般准则 在所有缓冲液中加在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸使所有半胱氨酸残基保持还原状态残基保持还原状态 加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性 用用 SDS PAGE 检查每一个组份中检查每一个组份中 DAOCS 利用酶测定法测量生物活性利用酶测定法测量生物活性79准备样品准备样品悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中悬浮细菌细胞在

34、溶解缓冲液中超声震荡破碎细胞超声震荡破碎细胞DNA 沉淀沉淀利用离心沉淀利用离心沉淀来源:从 S.Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增80选择粗提的层析技术选择粗提的层析技术 阴离子交换阴离子交换:快速快速,浓缩浓缩 样品处理最简单样品处理最简单 分离基础分离基础:电荷电荷 因为因为 DACOS 的的酸性酸性 pI 和不稳定性，和不稳定性，所以缓冲液选择中性所以缓冲液选择中性 pH81粗提粗提-在在 KTAFPLC 上优化梯度上优化梯度线性梯度线性梯度步级梯度步级梯度优化梯度优化梯度层析柱层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统系统:KTAFPL

35、C0102030min01002003001002003004000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min82选择中度纯化技术选择中度纯化技术 HIC:分离基础分离基础:疏水性疏水性 蛋白质疏水性质很难预测蛋白质疏水性质很难预测:筛选适合填料筛选适合填料 HIC 可以跟可以跟 IEX 互补衔接互补衔接,减少样品处理步骤减少样品处理步骤(只只需要加盐需要加盐)DAOCS 在高盐下能保持稳定在高盐下能保持稳定83

36、选择精细纯化的层析技术选择精细纯化的层析技术 GF:分离基础分离基础:分子量差异分子量差异 GF:最适合分离双体，寡聚体和聚合最适合分离双体，寡聚体和聚合物物84DAOCS-优化好的粗提步骤优化好的粗提步骤层析柱层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统系统:KTAFPLC浓缩样品浓缩样品快速去除有害物质快速去除有害物质01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm85DAOCS-优化好的中度纯化步骤优化好的中度纯化步骤层析柱层析柱:SOURCE 15ISO内径内径 16 mm,长度长度 50 mm系统系统:KTAFPLC HIC 和和 IEX 互补互补 浓

37、缩样品浓缩样品 除去大部分杂质除去大部分杂质01002001002003004000mlA280 nm86DAOCS-优化好的精细纯化步骤优化好的精细纯化步骤层析柱层析柱:HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade系统系统:KTAFPLC去除聚合物和余下的去除聚合物和余下的少量污染物少量污染物交换缓冲液交换缓冲液08060402010020040060080010000mlmAU87DAOCS-用用 SDS-PAGE 分析分析4321MMM-LMW 低分子量标记1-样品2-组份-Q Sepharose XL3-组份-SOURCE 15ISO4-组份-Superdex

38、 75 pg67k43k30k88DAOCS 纯化纯化-结果结果粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化08060402010020040060080010000mlmAU01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01002001002003004000mlmAu89DAOCS 纯化纯化-结果结果DAOCS 的高分辨电子密度图谱结晶 DAOCS 的 X-射线绕射图感谢瑞典农业科技大学的 Prof.Inger Andersson 和 Dr.Anke Terwisscha van Scheltinga,以及瑞典 Uppsala 大学生化系的 Dr.Karin V

39、alegrd 提供以上图片90中度纯化中度纯化DAOCS 纯化纯化-总结总结工艺工艺优化优化快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)优化好的纯化流程优化好的纯化流程样品准备样品准备HiPrep 16/10 Q XLSOURCE 15ISOHiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade 粗提粗提精细纯化精细纯化浓缩浓缩60 分钟分钟30分钟分钟40分钟分钟120分钟分钟80分钟分钟时间时间浓缩浓缩91KTA 平台层析系统纯化平台层析系统纯化 DAOCS-结论结论 DAOCS 纯度足够进行结晶纯度足够进行结晶 使用使用 KTA 平台层析系统的模板和快速探索平台层析系统的模板和快速探索(scouting)功能可以快捷有效地优化纯化工艺功能可以快捷有效地优化纯化工艺 纯化时间从纯化时间从 3 天减少到天减少到 6 小时小时9293谢谢谢谢欢迎您随时和我们联系欢迎您随时和我们联系北京北京(010)6487 3549上海上海(021)5080 0260广州广州(020)8732 0255香港香港(852)28117575