DNA甲基化和肿瘤ppt课件

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1、北京大学临床肿瘤学院病因室北京大学临床肿瘤学院病因室刘兆君刘兆君 liuzhaojunbjmu.eduliuzhaojunbjmu.edun表观遗传学概述表观遗传学概述nDNA甲基化与肿瘤甲基化与肿瘤nDNA甲基化检测技术的原理甲基化检测技术的原理 nDNA甲基化检测技术的运用甲基化检测技术的运用-epigenomics comes of age The genome contains information in two forms,genetics and epigenetics.The genetics provides the Blueprint for the manufacture

2、 of all the proteins necessary to create a living thing,while the Epigenetic information provides instructions on how,where,and when the genetic information should be used.-Keith D.Robertson,Oncogene 20:3-3155,2019 基因组基因组DNA序列没有发生改动的情况下，序列没有发生改动的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。导致了表型的变

3、化。cytosine5-methylcytosineNNNH2HONNNH2HOCH3DNMTS-A-MetnIn mammalian cells,methylation occurs only when Cytosine is followed by a Guanine;n1/16 in CpG islands and microbe genome;nThe CG frequency is much lower than that of expected rate(1%200 bpn 2.C+G/C+G+A+T 50%n 3.Observed CG/Expected CG 60%n By G

4、ardiner-Garden&Frommer,1987CpG甲基化形状的甲基化形状的可遗传性可遗传性-表遗传表遗传 DNMT1(Esteller,2019)n基因基因5端端(启动子及其临近序列启动子及其临近序列)CpG岛甲基岛甲基化形状影响基因表达；化形状影响基因表达；(Costello JF et al.,2019)n全基因组低甲基化；全基因组低甲基化；n个别个别CpG岛高甲基化；岛高甲基化；n肿瘤类别特异性；肿瘤类别特异性；n对对DNA损伤的早期顺应性反响；损伤的早期顺应性反响；n继续发生在癌变的启动、促进和继续发生在癌变的启动、促进和进展阶段。进展阶段。n与序列变异相比:一样重要 更易检

5、测-CpG岛甲基化：是或否；DNA构造变异：无数种；n与mRNA和蛋白质相比：检测灵敏-可反映个别细胞的变化；稳定性高-石蜡组织标本的资源优势n可逆性：新治疗靶点cytosine5-methylcytosineNNNH2HONNNH2HOCH3DNMTS-A-MetUridineCytosineNNNH2HONNHOOHH-OHH-NH2Methods to detect DNA CpG methylationnTo screen the genome restriction landmark genome scanning(RLGS),array hybridization(differen

6、tial methylation hybridization,DMH),bisulfite based oligo microarray,mass spectrometry,nTo analyze a given CpG island Southern blot,Bisulfite-PCR based:Sequencing,DHPLC,MSP,COBRA,Methylight,Primer-Extention,etc.digested with another enzyme,such as EcoRV(c),and separated in one dimension by agarose e

7、lectrophoresis in a capillary tube(d).The fractionated NotI/EcoRV fragments are further digested in situ with another enzyme,such as HinfI(e),after which they are electrophoresed through an acrylamide gel(f).Autoradiography discloses the radiolabelled fragments.By Eng C et al.,20005GCGGCCGC3Methylat

8、ion detection in RLGS profiles By Costello JF et al.,2000By Huang THM et al.,2000Bisulfite based oligo microarraynMss I Digestion(GTTT);nBisulfite Linker PCR;nOligo array:several flags,M and U;n232 CpG dinucleotides in 80 genes MggagtMgMgtttaccMgcataMgcagtMgtaagcaattgccatMggMgtaagcCggagtCgCgtttaccCg

9、catagCgcagtCgtaagcaattgccatCggCgtaagcBisulfiteMggagtMgMgtttaUUMgUatagMgUagtMgtaagUaattgUUatMggMgtaagUUggagtUgUgtttaUUUgUatgUgUagtUgtaagUaattgUUatUggUgtaagULinkerMggagtMgMgtttaUUMgUatagMgUagtMgtaagUaattgUUatMggMgtaagUUggagtUgUgtttaUUUgUatgUgUagtUgtaagUaattgUUatUggUgtaagUPolymeraseCggagtCgCgtttaTTCgTt

10、agCgTagtCgtaagTaattgTTatCggCgtaagTTggagtTgTgtttaTTTgTatgTgUagtTgtaagTaattgTTatTggTgtaagTLabeling,HybrizationCggagtCgCgtttaTTCgTtagCgTagtCgtaagTaattgTTatCggCgtaagTTggagtTgTgtttaTTTgTatgTgUagtTgtaagTaattgTTatTggTgtaagTCggagtCgCgtttaTTCgTtagCgTagtCgtaagTaattgTTatCggCgtaagTCggagtCgCgtttaTTCgTtagCgTagtCg

11、taagTaattgTTatCggCgtaagTTggagtTgTgtttaTTTgTatgTgUagtTgtaagTaattgTTatTggTgtaagTTggagtTgTgtttaTTTgTatgTgUagtTgtaagTaattgTTatTggTgtaagTMethylated DNA Unmethylated DNAMss IMethods to detect DNA CpG methylationnTo screen the genome restriction landmark genome scanning(RLGS),array hybridization(differenti

12、al methylation hybridization,DMH),bisulfite based oligo microarray,mass spectrometry,nTo analyze a given CpG island Southern blot,Bisulfite-PCR based:Sequencing,DHPLC,MSP,COBRA,Methylight,Primer-Extention,etc.甲基化敏感性酶切Southern杂交法亚硫酸氢钠处置的作用n未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶n5甲基胞嘧啶不转化n测序、COBRA、MSP、DHPLCC5MeCssPCRU5MeCTCNa

13、HSO3UridineCytosineNNNH2HONNHOOHH-OHH-NH2Single-stranded templates Natural template:double-stranded DNA5CCCGCGTTAAAGCCACGCTGGCCAACG3GGGCGCAATTTCGGTGCGACCGGTTGC Modified template:single-stranded DNA5TTCGCGTTAAAGTTACGTTGGTTAACG3GGGCGCAATTTTGGTGCGATTGGTTGC5TTTGTGTTAAAGTTATGTTGGTTAATG3GGGTGTAATTTTGGTGTG

14、ATTGGTTGTmethylatedunmethylated 引物设计时正义链不适宜可以针对反义链设计引物设计时正义链不适宜可以针对反义链设计Single-specific PCR(ssPCR)nModified single-stranded template:methylated one F:ttagggatattgTT5-ttagggatattgTTCGCGTTAAAGTTACGTTGGTTAACGggaattttgag R:ccttaaaactcunmethylated one F:ttagggatattgTT5-ttagggatattgTTTGTGTTAAAGTTATGTTGGTT

15、AATGggaattttgag R:ccttaaaactc引物设计：避开引物设计：避开CG点，最好引物点，最好引物3端包括游离的端包括游离的“C转换过来的转换过来的“T1.Bisulfite sequencing of the 5 region of COX2 in selected cell linesBy Toyota M et al.,2000Bisulfite-sequencing特点特点n优点：优点：n 可确定甲基化位点；可确定甲基化位点；n 甲基化检测金规范。甲基化检测金规范。n缺乏：缺乏：n 时间长，破费多，灵敏度低时间长，破费多，灵敏度低n 2.COBRA(Combined B

16、isulfite Restriction Analysis)COBRA主要用于检测目的主要用于检测目的DNA序列中含有的特殊酶序列中含有的特殊酶切位点的甲基化形状。其根本原理是亚硫酸氢钠处置后，切位点的甲基化形状。其根本原理是亚硫酸氢钠处置后，某些碱基序列的改动可以产生新的限制性内切酶图谱，即某些碱基序列的改动可以产生新的限制性内切酶图谱，即新的限制性内切酶作用位点出现或者消逝由新的限制性内切酶作用位点出现或者消逝由C-T转换所转换所致。这种新的图谱可以经过致。这种新的图谱可以经过PCR扩增，然后用特定限制扩增，然后用特定限制性内切酶的消化处置而显示出来。与对照组相比较，发生性内切酶的消化处置

17、而显示出来。与对照组相比较，发生变化的条带即能够为甲基化发生的区域。这种方法的任务变化的条带即能够为甲基化发生的区域。这种方法的任务量和耗费相对较小，但只能获得特殊酶切位点的甲基化形量和耗费相对较小，但只能获得特殊酶切位点的甲基化形状的信息，因此检测的阴性结果不能完全排除样本状的信息，因此检测的阴性结果不能完全排除样本DNA中中发生甲基化的能够性。发生甲基化的能够性。限制性内切酶及其酶切位点限制性内切酶及其酶切位点Bst UI:CGCG Taq I:TCGAMae II:ACGT Modified single-stranded template:methylated one F:ttaggg

18、atattg5-ttagggatattgTTCGCGTTAAAGTTACGTTGGTTAACGggaattttgag R:ccttaaaactcunmethylated one F:ttagggatattg5-ttagggatattgTTTGTGTTAAAGTTATGTTGGTTAATGggaattttgag R:ccttaaaactcHhaI GCG/CTaqI T/CGACOBRA检测特点检测特点n优点：优点：n 简便易行简便易行n缺乏：缺乏：n 单个或几个单个或几个CpG点检测，不能反响点检测，不能反响总体；总体；n 电泳检测，敏感性低电泳检测，敏感性低n n 3.DHPLC 3.DHP

19、LCDenaturing High Denaturing High PerformancePerformanceLiquid Liquid ChromatographyChromatography(WAVE DNA(WAVE DNA Fragment Fragment Analysis System)Analysis System)Separation of DNA Fragments on the DNASep Cartridge Double Stranded DNA Fragment Sizing Oligonucleotides Purification and Quality Con

20、trol Mutation Detection Methylation Detection Temperature ModulatedHeteroduplex Analysis(TMHATM)DHPLC法测定原理GCT/UAmCf-MBisulfiteConversionstrand-specificPCRf-UhybridizationHeteroduplexHomoduplexMUPromoter array data is verified by the DHPLC result.n反映整个片段的CpG甲基化形状；n可以定量；n经济、快速。n不能详细指出那些CpG位点甲基化。4.Meth

21、ylation-specific PCR(MSP)nModified single-stranded template:methylated one F:ttagggatattgTTCGCG5-ttagggatattgTTCGCGTTAAAGTTACGTTGGTTAACGgCGgaattttgag R:GCcGCcttaaaactcunmethylated one F:ttagggatattgTTTGTG5-ttagggatattgTTTGTGTTAAAGTTATGTTGGTTAATGgTGgaattttgag R:ACcACcttaaaactc引物设计：最好包括引物设计：最好包括3对以上的对

22、以上的CG点点 M RKO RKO 803 803 B1 B1 B2 B2 TE TEM UM UM U M UM U MSP of p16 甲基化和非甲基化对照的重要性甲基化和非甲基化对照的重要性200bpMSP检测特点检测特点n优点：优点：n 简便易行简便易行n 灵敏度高灵敏度高n缺乏：缺乏：n 单个或几个单个或几个CpG点检测，不能反响点检测，不能反响整个片段整个片段n 甲基化形状甲基化形状n n n By Eads CA et al.,2000MethyLight特点特点n优点：优点：n 灵敏度高灵敏度高n 可定量可定量n缺乏：缺乏：n 单个或几个单个或几个CpG点检测，不能反响整个点

23、检测，不能反响整个片段片段n 甲基化形状甲基化形状n n n 留意：不同的方法对引物的设计要求是不同的。留意：不同的方法对引物的设计要求是不同的。COBRACOBRA、DHPLCDHPLC中，引物中，引物不能含有不能含有CpGCpG双核苷酸序列。而双核苷酸序列。而MSPMSP、MethyLightMethyLight中，需求分别针对甲基化和中，需求分别针对甲基化和非甲基化的情况设计两类引物，而且至少要保证非甲基化的情况设计两类引物，而且至少要保证3 3对以上对以上CpGCpG双核苷酸序列存双核苷酸序列存在于引物中。在于引物中。运用运用n甲基化标志物甲基化标志物n某基因表达能否受甲基化调控？某基

24、因表达能否受甲基化调控？选择研讨的区段：基因启动子区或选择研讨的区段：基因启动子区或5UTR区区 n基因基因5端端(启动子及其临近序列启动子及其临近序列)CpG岛甲基岛甲基化形状影响基因表达；化形状影响基因表达；选择合理的研讨手段选择合理的研讨手段nCOBRAnMSPnMethyLightnDHPLCnPryosequencingnBisulfite-sequencing建立甲基化与基因表达的关系建立甲基化与基因表达的关系!运用实例：运用实例：芯片挑选：无相关甲基化研讨芯片挑选：无相关甲基化研讨 确认基因能否有确认基因能否有CpG岛岛63GFRa1基因基因522bp PCR产物产物DHPLC结

25、果与亚硫酸氢钠结果与亚硫酸氢钠-克隆测序结果比较克隆测序结果比较 ADHPLC检测结果；检测结果；B亚硫酸氢钠亚硫酸氢钠-克隆测序结果克隆测序结果AB甲基化检测：甲基化检测：DHPLC，Bisulfite-sequencingUmUm64GFRa1甲基化阴性GFRa1甲基化阳性AP0.001GFRa1甲基化与甲基化与GFRa1 mRNA转录程度呈负相关转录程度呈负相关.建立甲基化与建立甲基化与mRNA程度负相关关系程度负相关关系谢谢！谢谢！北京大学临床肿瘤学院病因室北京大学临床肿瘤学院病因室刘兆君刘兆君 liuzhaojunbjmu.eduliuzhaojunbjmu.edu简答题简答题 DN

26、A甲基化常用的检测技术有哪几种？各自的优缺陷有哪些？全基因组低甲基化的物质根底：反复序列全基因组低甲基化的物质根底：反复序列n拷贝数最多的基因：拷贝数最多的基因：Alu 基因，基因，LINE1n生理条件下绝大部分处于甲基化失活形状，有生理条件下绝大部分处于甲基化失活形状，有组织特异性；组织特异性；n在肿瘤发生的早期开场低甲基化活化，是基因在肿瘤发生的早期开场低甲基化活化，是基因交融、易位、缺失的热点，在肿瘤进展阶段发交融、易位、缺失的热点，在肿瘤进展阶段发扬作用。扬作用。Cell cycleFunction ApoptosisAngiogenesisDifferentiationDNA rep

27、airMetastasis/invasionDrug resistance/detoxificationSignal transductionTranscription/transcription factorsOtherGenes Death associated protein kinase(DAP kinase,9q34),Caspase 8(CASP8,2q33-34),Target of methylation induced silencing(TMS1,16p11.2-12.1)Thrombospondin-1(THBS1,15q15)Retinoblastoma(RB,13q1

28、4),p14ARF(9p21),Cyclin dependent kinase 2A(CDKN2A,9p21),Cyclin dependent kinase 2B(CDKN2B,9p21),p27/KIP1(12p13),p73(TP73,1p36),14-3-3(stratifin,SFN,1p)Myogenic differentiation antigen-1(MYOD,11p15.4),Paired box gene 6(PAX6,11p13),Retinoic acid receptor(RAR2,3p24),Wilms tumour 1(WT1,11p13)hMLH1(3p23-

29、p21.3),O-6-methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT,10q26)E-cadherin(CDH1,16q22.1),Tissue inhibitor of metalloproteinase 3(TIMP-3),Maspin(protease inhibitor 5,PI5,18q21.3)Glutathione S-transferase (GSTP1,11q13),Multi-drug resistance 1(MDR1,7q21.1)Adenomatous polyposis of the colon(APC,5q21-22),PTEN(

30、10q23.3),Androgen receptor(AR,Xq11-12),Oestrogen receptor 1(ESR1,6q25.1),Ras association domain family member 1(RASSF1A,3p21.3),Serine/threonine protein kinase 11(STK11 or LKB1,19p13.3)Von Hippel-Lindau syndrome(VHL,3p26-p25),Hypermethylated in cancer(HIC-1,17p13.3),Breast cancer,type 1(BRCA1,17q21)

31、CD44 antigen(CD44,11pter-p13),Cyclo-oxygenase 2(COX2,1q25.2-25.3),Calcium channel,voltage dependent,T type,alpha-1G subunit(CACNA1G,17q22),Calcitonin(CALCA,11p15.2-15.1),Fragile histidine triad gene(FHIT,3p14.2),Telomerase reverse transcriptase(TERT,5p15.33),Transmembrane protein containing epidermal growth factor and follistatin domains(TPEF,2q33),Chondroitin sulphate proteoglycan 2(CSPG2,5q12-14)By Costello JF et al.,2019