基因工程的基本技术

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1、第一章 基因工程的基本技术内容概要：电泳技术核酸印迹PCR技术琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要成分是D-半乳糖和3, 6脱水L-半乳糖连接 而成的一种线性多糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结 构；琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大 的孔径,高浓度的琼脂糖形成较小的孔径；琼脂糖凝胶的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶 可以分离不同大小范围的DNA片段。琼脂糖凝胶的制作： 将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,加热煮沸至溶液变为澄清,室温下冷却凝固即成。影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的大小、D

2、NA的构象、电压、电场方向以 及电泳缓冲液的组成。Agarose Concentration in Gel (% w/v)Range of Separation of Linear DNA Molecules (kb)0.30.60.70.91.21.52.05-601-200.8-100.5-70.4-60-2-30.1-2核酸分子带负电荷，电泳时，在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐，（Ethidium Bromide）。它能够插入 DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下

3、, 凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10 ng的DNA。注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套！核酸染色:1 ）先染法2 ）后染法观察与拍照在紫外灯（310nm波长）下观察染色后的凝胶ODNA存在处显示出红色的荧光条带。 紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外 光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。聚丙烯酰胺凝胶电泳1 100bp-1kb大小的DNA分子的分离2 RNA分子的分离3变性条件（加热或者6M脲素）脉冲电场凝胶电泳1可以分离100k b以下的

4、分子；2通过有规律地改变电场相对于凝胶的方向，而周期性地使DNA改变其迁移方向 来实现的；3对于电场方向的每次改变，DNA都必须重新安排它的轴线，然后沿新的方向迁 移；4目前最通用的是：曲线夹均匀电场电泳（CHEF）。核酸印迹目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于：检测特定基因的表达基因定位遗传病的检测组织病理学的研究生物分类方面核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出 现稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以 不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源 性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在:DNA 与 DN

5、ARNA 与 RNA 的二条单链之间进行RNA 与 DNA由于DNA般都以双链形式存在，因此在进行核酸印迹时，应先将双链DNA分子解 聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合 成双链的过程称为退火或复性 用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非 同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交转膜是指将核酸分子固定在膜上的过程。将核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接 将核酸点到膜上是核酸杂交过程中的主要步骤之一探针的标记探针的标记方法：切口平移随机引物用T4多核苷酸激酶标记DNA 5末端切口平移标记（nick translation

6、）DNase I控制其浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端和5-P末端DNA聚合酶I5-3外切酶活性将DNA 一条链的核苷酸切除，暴露单链DNA5-3DNA聚合功能将标记的dNTP加在3-OH末端结果使一条DNA的切口从左到右沿着DNA平移-切口平移随机引物随机引物：多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段，能与任何DNA模板的多个位点配 对互补。与切口平移法相比，随机引物法的优点：只需要一种酶条件易于控制 探针长度较为均一核酸探针的种类：DNA探针cDNA探针RNA探针 寡核苷酸探针探针的标记：放射性同位素标记非放射性检测系统生物素标记地高辛标记免疫金系统 碱

7、性磷酸酶系统 辣根过氧化物酶系统标记方法的选择：应考虑实验的要求，如：灵敏度和显示方法等 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高 在检测单拷贝基因的序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法 在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性 磷酸酶系统或辣根过氧化物酶系统核酸印迹的方法1 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)2 点杂交( Dot blot)3 Southern印迹杂交(Southern blot ) DNA4 Northern 印迹杂交( Northern blot )5 组织原位杂交( Tissue in s

8、itu hybridization )菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌 落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检 测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位点杂交法(Dot blot)点杂交法是将被检测标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样 准确方便，市售有多种多管吸印仪(manifolds )，如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio-Rad )和只丫 bri-Dot，它们有许多孔，样

9、品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈 斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的 膜就可以进行杂交Southern印迹杂交(Southern blot)DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术1 Southern blot： DNA DNA2是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及 PCR产物分析等方面有重要价值Souther n印迹杂交基本方法DNA标本限制性内切酶琼脂糖最胶电泳分离Northern 印迹杂交(Northern blot)1这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法

10、2 DNA印迹技术称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣 称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blotNorther n印迹杂交的RNA吸印与Souther n印迹杂交的DNA吸印方法类似，但是使RNA变性(尽管RNA是单链，但是有二级结构需去除)需用甲基氧化汞、乙二 醛或甲醛，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。RNA变性后有利于在转印 过程中与硝酸纤维素膜结合以及保持其单链状态组织原位杂交( Tissue in situ hybridization) 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交

11、(它与菌落的原位杂交不同)原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。 因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位臵，这一点具有重要的生物 学和病理学意义PCR：多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法1 1976年Chie n等分离出热稳定的Taq DNA聚合酶2 1985年 Kary Mullis及同事创立PCR技术3 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进入实用阶段4 1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反

12、应”而获得诺贝尔化学奖PCR 的特点及应用PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许 多领域：1、基因克隆、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序 等2、遗传病的产前诊断3、致病病原体的检测4、癌基因的检测和诊断5、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证6、动、植物检疫7、在转基因动植物中检查植入的外源基因的存在 原理及扩增过程：类似于DNA的变性和复性过程变性阶段 加热使模板DNA在高温下（901-95 ）变性，双链解链退火阶段 降低溶液温度，使合成引物在低温（35 - 651, 般低于模板Tm值的5左右），与模板DNA互补退火

13、形成部分双链延伸阶段 溶液反应温度升至中温（72）,在Taq酶作用下，以dNTP为料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后 延伸为两条双链PCR反应系统的组成主要包括：引物（终浓度：分别为1 uM）寡核苷酸（终浓度： 200 uM）Taq DNA聚合酶模板DNA （基因组DNA： 1 ug,质粒：1 pg）缓冲液引物设计的原则（G+C） %含量45- 55为宜,太少扩增效果不佳,太多则易出现非特异条带ATCG尽量随机分布，避免连续出现5个以上的嘌呤或者嘧啶核苷酸长度一般16- 25个核苷酸（最低不少于16个核苷酸,而最高不超过30个核苷酸 最佳长度为2024个核苷酸）有时可在5

14、端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完 成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5端加上额外的3-4个核苷酸， 以确保附加的酶切位点有效（保护碱基）两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱 基也不应大于 2 个碱基，否则易生成 “引物二聚体 ”或“引物二倍体 ” (Primer dimer)。引物的3端碱基应与模板严格配对，以避免因末端碱基不配而导致PCR失败引物内部应避免形成明显的次级结构，尤其是发夹结构(hairpin structures) 两条引物的Tm值要相同，(20个碱基左右的引物)可通过公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 计

15、算，适当增加或减少碱基ATGATCGATCGGCATTAGCCTGGGACTTAACCGGTTATCGATCGATGCCGTAATGCACGTAGGCTTGGCCAAATCGTATCGATGATCGATCGGCATTAGCCTGGGACTTAACCGGTTATCGATCGATGCCGTAATGCACGTAGGCTTGGCCAAATCGTATCGatgatcgatcggcattagcctgggacttaaccggttatcgatcgatgccgtaatgcacgtaggctjggcCAAATCGTATCG上游：5，GGAATTCCAIAIGATGATCGATCGGCATTAG-3，下游：5，CC

16、CAAGCTTCGATACGATTTGGCCA-3,Taq DNA聚合酶的选择EnzymeProofreading(3T J exonuclease)5-3?ExonucleaseHeat Stability (min before 50% activity remains)Processivitv (dNTP/ binding)ExtensionRate (dNTP/ s/niol)Tat DNAAbsentPresent9 at 97.5CC60-150polymerase(40-60 at95C. depending on protein concentration12 5Stoffel

17、 fraumentAbsentAbsent21 at 97.5C5-10130Ttii DAAbsentPresent25polymerase r Tth XLIiacePresent3( MOAmpliTaq CSAbsentAbsentLHTma DNAPiesentAbsent50 at 97.5Cpolvmerase(low)Pfu DNAPiesentAbsent1140 at 95CJ1岸Table I L4 Seiected Properties of Common Thermostable DNA Polymerasespolymerase (native and recomb

18、inant) Pfu DNApolymerase(cxo-foim) (PyygccHsspecies GB-D)AbsentPixsentAbsentAbsent1140 at 95C1380 at 95CC80(aka Deep480 at 100CTH PoJ(aka Venty)PixsentAbsent402 at 95CC67108 at 100CPixsentPresent7PlatinumHerciiJast enhanced DNAAbsentPresent150 at 96 CPie sentAbsent720 at 95C180 at 100C96 at 95C100-2

19、00100-300（激活DNA聚合酶的活性中心）tinum Ti7（fAbsentPresent 一显著影响PCR的产量以及产物特异性。过高容易出现非特异性的扩增，过低则影PlatinumAdvjPd._响酶的活性。一般使用浓度为1.5吨/駅 咖於1提供缓冲环境,P 8.0-9.3fu marl5(M060-150pCR反应条件的设臵心1AbsentSimilar to Taq5-fold greater than Tag DNA Polymerase变性温度和时间（90 C, 90s）复性温度和时间（温度40-60 C,与产物的特异性有关；时间30-60S）延伸温度和时间（温度一般为72 C

20、,与不同的聚合酶有关；时间与片段的长度有关，小于lkb的一般1 - 2min，片段大的时间要延长）循环数（ 2530）输入程序： edittemperaturenameminutesecondtemperatureminutesecondtemperatureminutesecondgo to stepcyclestemperatureminute secondend反转-PCR技术（RT-PCR）又称为RNA-PCR,是将mRNA反转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。反转录酶RT-PCR为经cDNA分离特定的基因提供一种通用、快速的手段定量RT-PCR(quantitative RT-

21、PCR) 基因表达的研究需要一个标准的RNA模板作为实验RNA的对照内参照: 细胞内在的持家基因的产物外参照：外源cDNA的产物随机扩增的多态性DNA技术(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)是标准的PCR技术的延伸特点：引物是随机合成或者任意选定的，故叫做武断引物或者任意引物(arbitrary primer)反应过程中，只有与DNA模板结合后，其距离最近、方向相对的两个引物之间的 模板DNA序列才能被扩增RAPD-DNA 指纹长度为10 or 11个碱基的单一固定引物可扩增出随机大小的DNA片段，DNA片段的多态性，即DNA指纹RAPD应用1

22、遗传图谱的制作2 基因定位与分离3 分类学研究4 临床诊断PCR-RFLP限制性片段长度多态性(RFLP)(Restriction Fragment Length Polymorphism)品系1品系2I 1 山 1丄 1 I 1一1L1 1 I II*“ 11 山 1 ii! li I 1 Hl I I 111 111 i 1 Lil 11IJM 1口 1 * ld_ll从同种的两个不同品系来源的染色体的3个区段在图中用水平线表示，垂直线表 示限制性内切酶的识别位点*号表示在品系2中存在着一个突变，由于这个突变导致品系 2基因组中失去了一 个限制性内切酶识别位点此识别位点的丢失可以通过RAP

23、D和RFLP两种方法检测出来品系111.用限制性内切酪解全墓因组DNA2.M0J片段按大小在 凝胶上进行分离 品系23. 将DNA转移到滤膜上4. 用含有点突变旁倒序列() 的标记探针进行杂交5. 放财自显齡品系|；4系21. PCR扩增2. 将PCR产物在胶上 按大小进行分离图10. 3 利用RFLP和RAPD对DNA片段进行多态性分析的比较(引自 Gibson, S.et al. , Tibtech 11： 306313,1993)mRNA差示技术(mRNA-differential display technique, mRNA-DD-PCR )在高等动植物细胞中有很多基因的表达有其特定

24、的模式，即具有细胞或者组织特 异性很多有应用前景的植物基因，如与合成有价值的次生代谢产物有关的基因，都是 在特定的组织中表达的可以通过分析基因的差示表达(differential expressed genes )来检定出特定 的基因mRNA差示技术的基本原理：1、将从两种不同有机体组织或者器官分离出来的mRNA用12种可能的寡核苷酸片 段引物中的一种引物进行反转录，得到cDNA的第一条链2、以此cDNA为模板，用10个核苷酸合成的随机引物及用于反转录的寡核苷酸为 引物，在一个标记的PCR反应中进行扩增3、产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影，分析形成的条带一般有三种情 况：a、对一种来源的

25、mRNA的PCR产物而言，某些PCR产物的带是独特的(或唯一的)b 、某些 PCR 产物在丰度上有变化c 、某些 PCR 产物在不同来源的 mRNA 中是等量的意义：获得有价值的已知或者未知的基因，为基因表达调控以及特定基因的分离 提供了一种有效的手段不对称PCR (asymmetric PCR)在PCR扩增中所用的一对引物的浓度不同典型的引物浓度比例是50：1或者100：1 在一条引物用尽后，在后面的循环中，过量产生两条链中的一条链 主要用途：产生特异性的单链DNA,可用做DNA序列分析的模板等原位PCR( In-situ PCR)在细胞(或者涂片)、组织(或者石蜡、冰冻切片)上直接进行 插

26、入标记基团直接显色或者间接显色 优点：可以定位检测,尤其是对于病原微生物的感染检测反向PCR( Inverse PCR)是一种简单的扩增已知序列周边未知序列的方法低浓度的DNA建立连接反应，使之 连接环化PCR产物I限制性内切酶消化巢式PCR （Nested PCR ）也称嵌套PCR,是指在PCR完成后，以PCR产物为模板，根据引物内侧的序列设计 新引物所做的PCR可以排除第一次扩增中出现的非特异性扩增引物1引物2:第一次扩增的PCR产物？引物3引物4第二次扩增的PCR产物荧光定量PCR荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑 系统和相应的分析软件通过荧光染

27、料或者荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实现在线 监控反应过程荧光定量PCR的标记方法1、内插染料（荧光染料SYBRgreen I）是一种能插入到DNA双链的小沟中并发出强烈荧光的化学物质 当没有与双链DNA结合时，没有荧光 其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比 缺点：对结合的双链DNA没有选择性，特异性不强2、水解探针（Taqman探针）是一种寡核苷酸探针，其序列对应于待扩增的目的DNA内部序列 5端标记荧光基团（receptor-R） 3端标记一荧光猝灭剂（quencher-Q） 探针游离或者退火阶段，荧光基团与猝灭剂接近，荧光强度很低 Taq酶有5外切活性，延伸阶段将5

28、端标记的荧光基团切下，使荧光基团与 猝灭剂分离，荧光基团发出荧光）3 、分子信标（发夹型杂交探针） 5端标记荧光分子，3端标记一个吸收或者猝灭荧光的分子，形成独特的茎 环结构，此时检测不到荧光，退火阶段与模板杂交而打开结构用于定量模板浓度、基因型分析、SNP检测优点：与特定序列的特异性强缺点：只能用于特定序列，成本高荧光定量PCR的优点：全封闭的PCR过程，无需跑电泳，无需后处理，结果分析更加快捷方便 对样品扩增的整个过程进行实时在线监控，能够实时地观察到产物的增加，直观 地看到反应的对数期 增加定量的精确性，在样品扩增反应的最佳时段进行数据采集降低反应的非特异性，使用引物和荧光探针同时与模板

29、特异性结合，提高了 PCR 反应的特异性PCR产物的克隆(1)1 A/T克隆法Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可以在DNA片段的3末端添加一个核苷酸, 通常为AT SP6Xmnl 200Seal 1890AmpfpGEMVector(3015bp)Apal AaUI Sphli BstZI Neo I BstZI Noll Sac 11 EcoRISpel EcoRl Notl BstZI PstlSallT7 IBstXI NsilTaq DNA聚合酶扩增的产物可以与T-载体进行连接，达到高效克隆的目的Apal Aatll Sphf BstZI Neol SacllSpelNoll

30、 BstZI Pstl Sll Ndel Sacl BstXHNsil2 具有校正活性的热稳定 DNA 聚合酶，如Pfu DNA 聚合酶Pwo DNA 聚合酶Tli DNA 聚合酶在进行PCR扩增时产生平端PCR产物PCR-Blunt克隆载体：在LacZ基因的下游融合了一个ccdB基因，该基因对大肠杆菌是致死的，如果 载体发生自连，转化的大肠杆菌宿主就会死亡，只有连接外源DNA片段，ccdB基因 的表达受到阻断，含有重组质粒的大肠杆菌才会存活下来lac_prLirno tmrM13_p I匚厂 p _p r i m e r M13_revprsp_primer Sp6_prirriprHindiII 276pElR322_i：iriginOral 2639sh_bleSmal 2328Aat.II 2284Kpnl 286SacIBamHI 294|pel 300Aflll 334NEOKAN_promoterElcll 1206Am pR_ promo ter-M13_plJ C _fw d_p r i m er lacZ_accdEl