ling7RNA二级结构找基因

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1、 3.9 RNA二级结构预测背景背景:以前人们认为，绝大部分的RNA分子要么是蛋白质基因表达的信使分子(mRNA)，要么是协助完成基因表达的结构分子(tRNA和rRNA)。但是，近几年来，人们发现了很多新的RNA分子，它们虽然也从基因组DNA中转录而来，它们不是tRNA和rRNA以及其他已知的RNA(如snRNA)，又不表达为蛋白质，因此也不是mRNA。不管是原核生物还是真核生物，都存在这类RNA分子，原核的情况下称为small RNA(sRNA)，真核的情况下通常称为 noncoding RNA(ncRNA)。人们发现，这一类RNA分子起着非常重要的生物学功能，如影响发育过程、调节转录、影响

2、染色体复制、对RNA进行加工和修饰、影响mRNA的稳定性进而影响翻译、甚至影响蛋白质的降解和转运，等等。这一类RNA分子一般通过两种机制发挥功能：1.和目标分子形成碱基配对,如 RNAi;2.形成空间结构,如核酶(ribozyme)。现在，越来越多的科学家开展了对这类RNA的研究，SCIENCE杂志连续几年将之评为十大热门研究领域之一。在这种形势下，对RNA结构的预测就显得格外重要。一条单链RNA可以折叠成非常多可能的二级结构，这种可能的数目随着序列的长度呈指数增长。一条200个碱基的RNA，就有1050种可能的结构，而一般说来，正确的只有一种。必须有一种评价函数(指标)，使得正确结构对应的值

3、最大(或最小)。3.9.1 RNA结构的特征和术语结构的特征和术语 因为RNA是单链分子，在实际的生物体环境中它会折叠起来，形成很多的茎(stem)和环(loop)。绝大部分的茎环结构互相之间是“嵌套”关系(nested),即对于任意两对碱基对(i,j)和(m,n)，要么 imnj，要么 mij=j,继续取堆栈；如果 (i+1,j)=(i,j)，放(i+1,j)入堆栈；如果 (i,j-1)=(i,j)，放(i,j-1)入堆栈；如果 (i+1,j-1)+(i,j)=(i,j)记录(i,j)碱基对，放(i+1,j-1)入堆栈；前三种情况不止一种成立时，须综合考虑 否则 for k=i+1 to j

4、-1:if(i,k)+(k+1,j)=(i,j)放(k+1,j)和(i,k)入堆栈并跳出循环；选取不同的回选取不同的回溯路径得到不同的结构溯路径得到不同的结构 注意：注意：回溯的线路经常不是唯一的，所以结构也是不唯一的，其中有些显然是不可能的。另外，这种方法无法考虑“假结”(pseudoknot)的情况。这种算法可以加以推广，比如让GC配对得3分，而AU配对得2分，这时候只需对(i,j)函数重新定义即可。3.9.3自由能最小化自由能最小化(Zuker)方法简介方法简介文献：文献：Nucleic Acids Research 9:133-148,1981 Methods in Enzymolog

5、y 180:262-288,1989 实际上，RNA折叠的真正动力是链内“相互作用”的而不是“数碱基对”。Zuker方法是一种自由能最小化方法，它假设正确的结构应具有最低的自由能(G)。Zuker方法中G被近似为来自loops,base pairs 及其他二级结构元素的贡献之和。对于一个stem，其贡献计算为碱基对的“堆积能”而不是简单的各碱基对贡献之和。例如，一个有n个碱基对的stem,其贡献是n-1个堆积能之和。详细规则参考：PNAS 83：9373-9377，1986有了这些规则，运用类似于前面Nussinov方法中的动态规划算法(当然实际要复杂很多，但思想一样)，就可获得可能为可能为自

6、由能最小化的二级结构。3.9.4 多序列多序列alignment法的基本思路法的基本思路 一个生物分子，如果它主要依靠其结构发挥功能，则一般地其结构的保守性要高于其序列的保守性；对于结构RNA中的stem，为了保证其结构不被破坏，就有了碱基“协同突变”的特点：根据这个特点，我们能很有把握地推测其二级结构。显然，位点对位点对(2,9)提供了比其它位点对更多更可靠的二级结构信息。信息论中一种称为mutual information的指标恰好能定量计算这种信息，公式为：.;),(log,2列中出现的概率和第在第是观察到的碱基对列中出现的概率在第之一是观察到的碱基jixxfiGACUxfffffMji

7、xxixxxxxxxxxijjiijijijijiMij的意义是：i,j 两列的实际变化偏离“各自独立变化”的程度。例1：ijUAUAUAUAMij=0例2：ijUACGAUGCMij=2例3ijUAUAGCGCMij=1例4：ijUCUAGCGAMij=0思考，如何将其和具体的生物学意义联系起来？基于一千多个tRNA的多序列alignment,可以画出右图上部的mutual information 图。对照酵母 tRNA-Phe的二级结构结构(右图下部)，可以发现，上图中的4簇尖峰和下图中的4个臂完全吻合，甚至因在三级结构上靠近而产生的相关(虚线)也有所体现。到目前为止，这种基于多序列ali

8、gnment的RNA二级结构预测方法是公认的最成功方法，但是需要很多条件。3.9.5 网上网上RNA二级结构预测软件二级结构预测软件Mfold server,网址：http:/frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1.cgiVienna RNA Package，网址：http:/www.tbi.univie.ac.at/ivo/RNA/其中的程序RNAfold用的就是自由能最小化(Zuker)方法；GeneBee 服务器,网址：http:/www.genebee.msu.su/services/rna2_redu

9、ced.html.利用利用GeneBee服务器的一个示例服务器的一个示例稍等几分钟稍等几分钟,即可看到结果即可看到结果:注意注意:同一个序列用不同的预测程序可能得到不同的结果；如果一条较短序列是一条较长序列的子序列，即使用同一个程序预测，短序列的结构可能和长序列的相应部分的结构不同；同一个序列同一个程序，但条件参数不同，也会得到不同的预测结构。3.10 找基因找基因3.10.1 在基因组DNA序列中寻找编码区 基于编码区特征的方法 基于数据库的方法 注意两类假基因(pseudogenes)3.10.2 基因的电脑克隆3.10.3 几个常用软件服务器CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGA

10、TCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCC

11、GCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAAC

12、TCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATACTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTA

13、CGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGATTGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCC

14、TCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGC 3.10.1 在基因组DNA序列中寻找编码区基于编码区特征的方法优点：不必依赖于数据库(不必学习和训练)，普适性强。缺点：准确度低，特别是对于真核基因，由于其高度复杂性，预测的准确率更低。1.寻找长ORF 该方法较适用于原核生物，例如，我们从某

15、种细菌中测得以下序列：MYSEQ1 310 bpMYSEQ1 310 bpggcgtcgccgccgatggcgcttaggcgtagcatggggtggccggggctacggccgctgctggcgtcgccgccgatggcgcttaggcgtagcatggggtggccggggctacggccgctgctgctggcgggactggctaatctgctgctacccgggtctgcggccgcaggcctgaagctcatgctggcgggactggctaatctgctgctacccgggtctgcggccgcaggcctgaagctcatgggcgccccagttaagatgaccg

16、tgtctcaggggcagtcagtgaagctcaactgcagcgtgggcgccccagttaagatgaccgtgtctcaggggcagtcagtgaagctcaactgcagcgtggaggggatggaggaccctgacatccactggatgaaggatggcaccgtggtccagaatgcggaggggatggaggaccctgacatccactggatgaaggatggcaccgtggtccagaatgcaagtcaggtgtccatctccatcagcgagcacagctggattggcttactcagccttaagtcaagtcaggtgtccatctccatca

17、gcgagcacagctggattggcttactcagccttaagtcagtggagcggagtggagcgg我们可以将它按六种读框将它硬行翻译成蛋白序列：RF-3 T A A S P A RF-3 T A A S P A *A Y C P T A P A V A A A A Y C P T A P A V A A A RF-2 A D G G I A S L R L M P H G P S R G S S RF-2 A D G G I A S L R L M P H G P S R G S S RF-1 R R R R H R K P T A H P P R P RF-1 R R R R

18、 H R K P T A H P P R P *P R Q Q P R Q Q 3 compl ccgcagcggcggctaccgcgaatccgcatcgtaccccaccggccccgatgccggcgacga 53 compl ccgcagcggcggctaccgcgaatccgcatcgtaccccaccggccccgatgccggcgacga 55 1 ggcgtcgccgccgatggcgcttaggcgtagcatggggtggccggggctacggccgctgct 3 5 1 ggcgtcgccgccgatggcgcttaggcgtagcatggggtggccggggcta

19、cggccgctgct 3 RF1 G V A A D G A RF1 G V A A D G A *A A *H G V A G A T A A A H G V A G A T A A A RF2 A S P P M A L R R S M G W P G L R P L L RF2 A S P P M A L R R S M G W P G L R P L L RF3 R R R R W R L G V A W G G R G Y G R C RF3 R R R R W R L G V A W G G R G Y G R C RF-3 A P P V P RF-3 A P P V P *D

20、 A A V R T Q P R L G S A D A A V R T Q P R L G S A *RF-2 S A P S A L R S S G P D A A A P R F S M RF-2 S A P S A L R S S G P D A A A P R F S M RF-1 Q R S Q S I Q Q RF-1 Q R S Q S I Q Q *G P R R G C A Q L E H G P R R G C A Q L E H 3 compl cgaccgccctgaccgattagacgacgatgggcccagacgccggcgtccggacttcgagta 53

21、 compl cgaccgccctgaccgattagacgacgatgggcccagacgccggcgtccggacttcgagta 55 61 gctggcgggactggctaatctgctgctacccgggtctgcggccgcaggcctgaagctcat5 61 gctggcgggactggctaatctgctgctacccgggtctgcggccgcaggcctgaagctcat 3 3 RF1 A G G T G RF1 A G G T G *S A A T R V C G R R P E A H S A A T R V C G R R P E A H RF2 L A G L

22、 A N L L L P G S A A A G L K L M RF2 L A G L A N L L L P G S A A A G L K L M RF3 C W R D W L I C C Y P G L R P Q A RF3 C W R D W L I C C Y P G L R P Q A *S S S S RF-3 P R G L RF-3 P R G L *S S R T E P A T L S A S S R T E P A T L S A *S C R S C R RF-2 P A G T L I V T D RF-2 P A G T L I V T D *P C D T

23、 F S L Q L T P C D T F S L Q L T RF-1 A G W N L H G H R L P L RF-1 A G W N L H G H R L P L *H L E V A A H H L E V A A H 3 compl cccgcggggtcaattctactggcacagagtccccgtcagtcacttcgagttgacgtcgca 53 compl cccgcggggtcaattctactggcacagagtccccgtcagtcacttcgagttgacgtcgca 55 121 gggcgccccagttaagatgaccgtgtctcagggg

24、cagtcagtgaagctcaactgcagcgt 3 5 121 gggcgccccagttaagatgaccgtgtctcaggggcagtcagtgaagctcaactgcagcgt 3 RF1 G R P S RF1 G R P S *D D R V S G A V S E A Q L Q R D D R V S G A V S E A Q L Q R RF2 G A P V K M T V S Q G Q S V K L N C S V RF2 G A P V K M T V S Q G Q S V K L N C S V RF3 W A P Q L R RF3 W A P Q L

25、 R *P C L R G S Q P C L R G S Q *S S T A A S S T A A RF-3 P P S P P G Q C G S S S P H C R P G S H RF-3 P P S P P G Q C G S S S P H C R P G S H RF-2 S P I S S G S M W Q I F S P V T T W F A RF-2 S P I S S G S M W Q I F S P V T T W F A RF-1 L P H L V R V D V P H L I A G H D L I C RF-1 L P H L V R V D V

26、 P H L I A G H D L I C 3 compl cctcccctacctcctgggactgtaggtgacctacttcctaccgtggcaccaggtcttacg 53 compl cctcccctacctcctgggactgtaggtgacctacttcctaccgtggcaccaggtcttacg 55 181 ggaggggatggaggaccctgacatccactggatgaaggatggcaccgtggtccagaatgc5 181 ggaggggatggaggaccctgacatccactggatgaaggatggcaccgtggtccagaatgc 3 3

27、RF1 G G D G G P RF1 G G D G G P *H P L D E G W H R G P E C H P L D E G W H R G P E C RF2 E G M E D P D I H W M K D G T V V Q N A RF2 E G M E D P D I H W M K D G T V V Q N A RF3 W R G W R T L T S T G RF3 W R G W R T L T S T G *R M A P W S R M R M A P W S R M RF-3 L D P T W R W RF-3 L D P T W R W *R A

28、 C S S Q S V R A C S S Q S V *G G *T T RF-2 L RF-2 L *T D M E M L S C L Q I P K S L R L D T D M E M L S C L Q I P K S L R L D RF-1 T L H G D G D A L V A P N A RF-1 T L H G D G D A L V A P N A *E A K L E A K L *3 compl ttcagtccacaggtagaggtagtcgctcgtgtcgacctaaccgaatgagtcggaattcag 53 compl ttcagtccacag

29、gtagaggtagtcgctcgtgtcgacctaaccgaatgagtcggaattcag 55 241 aagtcaggtgtccatctccatcagcgagcacagctggattggcttactcagccttaagtc 3 5 241 aagtcaggtgtccatctccatcagcgagcacagctggattggcttactcagccttaagtc 3 RF1 K S G V H L H Q R A Q L D W L T Q P RF1 K S G V H L H Q R A Q L D W L T Q P *V V RF2 S Q V S I S I S E H S W

30、 I G L L S L K S RF2 S Q V S I S I S E H S W I G L L S L K S RF3 Q V R C P S P S A S T A G L A Y S A L S RF3 Q V R C P S P S A S T A G L A Y S A L S RF-3 L P A RF-3 L P A RF-2 T S R RF-2 T S R RF-1 H L P RF-1 H L P 3 compl tcacctcgcc 53 compl tcacctcgcc 55 301 agtggagcgg5 301 agtggagcgg 3 3 RF1 S G

31、A RF1 S G A RF2 V E R RF2 V E R RF3 Q W S RF3 Q W S 我们可以直观地看出，读框 2 没有碰到终止密码子，所以这段序列可能是蛋白质基因。如果能在被预测为基因的上游的合适位置上找到转录promoter中的保守序列：-10位置的“TATAAT”(T80 A95 T45 A60 A50 T96)-35位置的“TTGACA”(T82 T84 G78 A65 C54 A45)就可增加基因预测的可信度。2.利用周期特性找编码区原则上说，任何能研究序列周期特性的方法和软件都可以用来探测编码区，如D值得方法(以前讲过)，各种频谱分析方法等等。3.利用其他特征找编

32、码区编码区除了有大的开读框架和周期3特性外，还有其它一些特征，如序列复杂度和分维度(后面讲)较高，GC含量高等等，这些都可以被用来寻找或帮助寻找编码区。基于数据库的方法1.同源性比较法2.经验规律符合法3.通过和EST序列的比较来定位基因1.同源性比较法同源性比较法将新测得的序列直接和数据库中的已知基因序列或蛋白质序列作同源性比较(BLAST和FASTA);若序列相似性在35%以上、期望值E在0.01以下，就基本上可以确定是基因序列;若相似性特别高，又属于同一物种，则很可能不是新的基因。优点：准确性高，且可预测其编码蛋白质的功能。缺点：很多新的基因在数据库中还找不到同源序列，因而无法用这种方法

33、检测到。2.经验规律符合法经验规律符合法即通过对已知基因的序列特征进行训练学习、总结出规律，再用这个规律来检验新测得的序列，以判断其是否为基因序列，如前面讲过的密码子使用频率方法。另外，马尔科夫链方法(后面讲)以及神经网络(用来预测编码区时)也属于这类方法。优点：是目前寻找新基因的最常用、最有效的方法，准确度也高。缺点：若已有数据不足或数据集选取不当，会影响预测的准确性。另外，对不同的物种常有不同的规律，需要对不同数据集体进行学习和总结，比较麻烦。3.通过和通过和EST的比较来定位基因的比较来定位基因EST 是 Expressed Sequence Tag 的缩写，实际上是一些cDNA序列的片

34、段，长度一般为400到500 bp。但是，实验中测到的EST序列来源于哪个基因，是基因的哪一部分是随机的，无法事先确定。利用EST序列和基因组序列的比较来确定基因在基因组中的位置，甚至进一步确定基因的精细结构(exon,intron,splicing sites)原则上是可能的。mRNA的可变剪接的可变剪接EXON1INTRON1EXON2INTRON2EXON3INTRON3EXON4Pre-mRNAPre-mRNA正常剪接正常剪接EXON1 EXON2 EXON3 EXON4成熟成熟mRNA1mRNA1可变剪接可变剪接EXON1 EXON3 EXON4成熟成熟mRNA2mRNA2可变剪接可

35、变剪接EXON1 EXON2 EXON4成熟成熟mRNA3mRNA3优点：可以确定基因的精细结构并将其在基因组上定位，这是其他方法难以做到的。现在对人类基因组中基因的标注，很多都采用这个办法。缺点：EST数据库中的数据含有大量的错误，给方法的实施带来很大的困难。另外，由于基因组DNA和EST序列的数据量都十分庞大，导致计算量也十分庞大。注意两类假基因注意两类假基因(pseudogenes)第一类假基因:基因的复制(duplication)会产生相同的基因一前一后紧邻出现的情况。当其中一个积累了太多的有害突变而失去功能时，就成了假基因。由于还有另一个基因发挥正常功能，所以物种仍可存活。第二类假基

36、因:称为“processed pseudogenes”。这类基因也源自正常基因，但没有内含子，其上游也没有promoter。推测这类假基因的产生过程是：正常基因经转录剪接得到成熟mRNA，随后反转录为cDNA，再经转座作用插入染色体的某个位置。3.10.2 基因的电脑克隆 EST是对应于表达基因的cDNA的一些随机片段，长度一般在400到500bp之间。这些片段相互之间可能有重叠的部分。现在公共EST数据库(如NCBI的dbEST)中人类EST序列总长估计已是人类基因外显子总长的十几倍，所以这种重叠是显而易见的。因此，通过对EST序列的比对拼接，得到全长cDNA序列是完全可能的；进一步，可以对

37、拼接所得的全长cDNA进行分析，找出可能的新基因。这样的过程就称为基因的电脑克隆。EST序列数据库的形成序列数据库的形成EST 序列数据库SiClone 流程图流程图数据准备，包括：序列纯化及格式标准化 取出一条种子库大 库种子和大库的序列比对判断种子序列能否被延长能 延延长长了了的的序序列列代代替替旧旧序序列列否结束，放入contig库几个技术问题判断能否拼接的标准：1.要求的重叠区最小序列相似性 2.要求的重叠区最小长度 3.允许的“坏接头”最大长度如何决定新的序列 1.库序列的一致性问题 2.碱基“投票”进入 http:/ 几个常用软件服务器几个常用软件服务器1.ORF Finder h

38、ttp:/ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html 2.GeneMark http:/opal.biology.gatech.edu/GeneMark/3.GENSCAN http:/bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/genscan.html4.GlimmerM http:/www.tigr.org/software/glimmerm/5.TigrScan http:/www.tigr.org/software/pirate/tigrscan/TigrScan-menu.htmlORF finder:适用于不太长的序列，列出所有的开

39、度框架。GeneMark：是个程序包，包含基于不同模型，适用于不同物种的多个程序。比如其中的GeneMark.hmm程序，是基于隐含马尔科夫模型的，适用于真核生物基因预测的程序。GENSCAN：适用于在真核生物基因组中寻找基因。GENSCAN的结果页面GlimmerM:适用于小的真核生物基因组。它先用interpolated Markov model找出所有可能的EXONs,然后用动态规划法找出组成基因的EXONs的最佳组合。你可以将GlimmerM程序包下载，然后安装在自己的计算机上，也可以直接使用GlimmerM服务器：实际上，TIGR早期开发的是Glimmer，用来在原核生物（真细菌和古

40、细菌）基因组中寻找基因。TigrScan:based on the Generalized Hidden Markov Model framework 实例：几个程序对人类第13号染色体中一段长度为序列11200 nt的DNA序列的基因预测。基因组注释基因组注释预报1个基因。GeneMark预报1个基因。GENSCAN预报2个基因。其中基因1为：GlimmerM预报9个基因。其中基因3为：基因结构61141229723149995101481109411140229723149976101489976101481039910498105461083019802063229723142440246524752526可见，这些程序的预报结果都不一样，这说明真核基因的预报结果仍然很不可靠。