DNA测序仪的测序原理和操作规程

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1、DNA测序仪的测序原理和操作规程DNA测序仪DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括sanger双脱氧链终止法 和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主 流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测 序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是abi prism 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。原理abi prism 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统 的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物

2、 法)，因此通过单引物per测序反应,生成的per产物则是相差1个碱基的3末 端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序per产物可在 一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确 度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口 段时,激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光 分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的 荧光，并在ccd摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从 而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝

3、胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺 序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测 定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。pe公司还提供凝胶高分子 聚合物，包括DNA测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。这些凝胶颗粒孔径均一， 避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、macintosh 电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的ccd摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h,pcr片段大小分 析和定量分析为1040min。由于该仪器具有DNA测序,pcr片

4、段大小分析和定量分析等功能，因此可进行 DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段 per、rt-pcr(定量pcr)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷 酸多态性(snp)分析、基因突变检测、hla配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微 生物与病毒的分型与鉴定等。试剂与器材1. bigdye测序反应试剂盒主要试剂是bigdye mix,内含pe专利四色荧光标记 的 ddntp 和普通 dntp,amplitaq DNA polymerase fs,反应缓冲液等。2. pgem-3zf (+)双链DNA对照模板0.2g/l，试剂盒配套试剂。3.

5、 ml3(-21)引物 tgtaaaacgacggccagt,3.2 口 mol/l,即 3.2pmol/ul,试剂盒配 套试剂。4. DNA测序模板可以是pcr产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整 在pcr反应时取量1口 l为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/l,即 200ng/ulo5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2umol/l, 即3.2pmol/ 口 l。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如m13(-21)引 物,t7引物等。6. 灭菌去离子水或三蒸水。7.0.2ml或和0.5ml的pcr管盖体分离,pe公司产品。8.3mo

6、l/l醋酸钠(ph5.2)称取40.8g naac?3h2o溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸 调ph至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。9.70%乙醇和无水乙醇。10. naac/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混匀，室温可 保存1年。11. pop 6测序胶abi产品。12. 模板抑制试剂(tsr) abi产品。13.10X电泳缓冲液abi产品。14.abi prism 310型全自动DNA测序仪。15.2400 型或 9600 型 per 仪。16. 台式冷冻高速离心机。17. 台式高速离心机或袖珍离心机。操作步骤per测序反应(1) 取0.2ml的

7、per管,用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：所加试剂测定模板管标准对照管bigdye mix 1口 l 1口 l待测的质粒DNA 1口 l -pgem-3zf (+)双链 DNA -1口 l 待测 DNA 的正向引物 1口 l -m13(-21)引物- 1口 l灭菌去离子水2 口 l 2 口 l总反应体积5ul,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧per 管,用手指弹管混匀,稍离心。(2) 将per管置于9600或2400型per仪上进行扩增98C变性2min后进行 per循环,pcr循环参数为96C10s,50C5s,60C4min,25个循环，扩增结束后设置 4C保温。醋酸钠/乙醇法纯化

8、per产物(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。(2) 加入25 口 l醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA12 000r/min于4C离心30 min,小心弃上清。(3) 加70%(v/v)的乙醇50 口 l洗涤沉淀2次。12 000r/min于4C离心5min, 小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀1015min。电泳前测序per产物的处理。(1) 加入12 口 l的tsr于离心管中，剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀，稍离 心。(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml per管中，稍离心。(3) 在per仪上进行热变性(95C2min),冰中骤冷

9、，待上机。分析或打印出彩色测序图谱上机操作按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kv预电泳5min,按编 程次序自动进样，再预电泳(1.2kv,20min),在7.5kv下电泳2h。电泳结束后仪器会 自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳 结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。序列分析仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知, 可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。处理仪器测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。计算测序反应精确度

10、计算公式：100%-差异碱基数(不包括n数)/650X100%差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,n为仪器不 能辨读的碱基。注意事项与评价1. abi prism 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。2. 本实验测序per反应的总体积是5 口1,而且未加矿物油覆盖，所以per管盖 的密封性很重要，除加完试剂后盖紧per管盖外，最好选用pe公司的per管。如 per结束后per液小于44.5 口1,则此per反应可能失败，不必进行纯化和上样。3作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序per反应 使用的模板不同，需要的DNA量也就不

11、同,pcr测序所需模板的量较少，一般per产 物需3090ng,单链DNA需50100ng,双链DNA需200500ng,DNA的纯度一般是 a260nm/a280nm为1.62.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用te缓冲液溶 解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmo1/ 口1较好。4.本实验使用的测序试剂盒是bigdye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一 般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.50.5) %，仪器不能 辨读的碱基n2%,所需测定的长度超过了 650bp,则需设计另外的引物。为保证测序 更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于 n 碱基可进行人工 核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该 处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对继续阅读