显微镜的使用及微生物形态观察

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1、10实验.1 显微镜的使用及微生物形态观察10。11 目的要求了解光学显微镜的结构、各部分的功能；掌握光学显微镜的使用、保养方法;观察微生物的形态，学会生物图的绘制。01. 器材和材料1。1.2。1 仪器或其它用具光学显微镜、镜纸、吸水纸等.0.1.2.2 溶剂或试剂镜油:香柏油或石蜡油。镜头清洗液：二甲苯或醚醇清洗液(乙醚0mL，无水乙醇30mL）.1.1。2。 菌种米酒酵母、链霉菌、青霉、曲霉、根霉等装片。0.1. 实验内容10.3 显微镜的基本结构普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成，见图10。1。图。1 显微镜构造示意图 目镜；. 镜筒; 镜臂；4标本移动器;。 粗动限位器；6.粗调

2、节器；7. 细调节器；8.镜座;9. 反光镜;10。 虹彩光圈；1. 聚光器;1 载物台;3。物镜；14. 物镜转换器(引自钱存柔、黄仪秀。 微生物学实验教程 北京：北京大学出版社 1999)机械部分镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上。镜臂用以支撑镜筒,也是搬动显微镜时手握的部位。镜筒是连接目镜和物镜的金属筒。镜筒上端插入目镜,下端与物镜转换器相接。载物台是放置标本的地方。镜台上有压片夹用以固定被检标本，较好的显微镜则有标本移动器,转动螺旋可使标本前后和左右移动。有的标本移动器带有游标尺,可定位标本所在位置。物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有34个不同放大倍数的物镜，可以通过转

3、动物镜转换器选用合适的物镜。调节器安装在镜臂的基部，是调节物镜与被检标本之间距离的装置，通过转动粗调节器和细调节器便可清晰地观察到标本。光学部分物镜是显微镜中很重要的光学部件.根据物镜的放大倍数和使用方法的不同,分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，常用的放大倍数为低倍物镜10、高倍物镜40、油镜100。目镜是把接物镜放大的实像再放大一次,并把物像映入观察者的眼中。通常有5、10等规格.聚光器安装在载物台下,能将平行的光线聚焦于标本上,增强照明度.聚光器可以升降，升高时增强光强,下降时减弱光强。虹彩光圈附于聚光器内部,可开大或缩小，以调节进入镜头的光线的强弱。光圈大小应适当，使物像能得到更清晰的效

4、果.反光镜是普通光学显微镜的取光设备,使光线射向聚光镜,分平、凹两面，使用低倍镜和高倍镜均应用平面镜;凹面镜聚光力强,适合于光线较弱时，一般在使用油镜时用凹面镜。内光源是较好的光学显微镜自身带有的照明装置，安装在镜座内部，由强光灯泡发出的光线通过安装在镜座的集光镜射入聚光镜.其强弱可进行调节。01.3。 显微镜的使用方法（1） 显微镜的取用和放置从显微镜箱或柜内取出显微镜时，应一手提镜臂,另一手托镜座，让显微镜直立,防止目镜从镜筒中脱落.显微镜应直立放置在桌上.离桌缘cm,检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁.（2） 标本放置下降载物台或升高镜筒，使物镜远离载物台。将低倍镜转至正下方,把标本

5、玻片置于载物台上,用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。（3） 低倍镜观察侧面注视，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近,距离约0。5m处,开放光圈,下降聚光器.选用平面反光镜并调节其角度,使视野内光线均匀，亮度适宜。如有内置光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。再由目镜观察，同时转动粗调节器下降载物台或升高镜筒，使物镜逐渐远离玻片，标本在视野中显现后,再使用细调节器调节至图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位,找到合适的目的物,仔细观察并记录所观察到的结果。（4） 高倍镜观察在低倍镜下找到合适的目标并将其移至视野中心后,侧面注视，轻轻转动

6、物镜转换器将高倍镜移至正下方。适当调节聚光器光圈及视野亮度，用细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本，仔细观察并记录所观察到的结果.在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后,转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时,物像将保持基本准焦状态,这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时，仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。（5） 油镜观察使用同焦显微镜时，在高倍镜或低倍镜下找到要观察的区域后,移开镜头，在待观察的区域滴加12镜油,将油镜转至油中,调节光强，使视野的亮度合适,用细

7、调节器调节物像清晰为止。对于不等焦的显微镜，用粗调节器下降载物台或升高镜筒,使物镜逐渐远离玻片，在标本观察区滴加镜油,然后将油镜转至镜筒下方,须在侧面注视下，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，将油镜前端浸入镜油中,并几乎与标本相接。将聚光器升到最高位置并开足光圈,调节照明,使视野的亮度合适，用粗调节器上升镜筒或下降载物台,使物镜缓慢离开玻片,直至视野中出现物像，并用细调节器使其清晰准焦为止。有时按上述操作还找不到目的物,则可能是油镜头下降或载物台提升还未到位,或因油镜上升或载物台下降太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像.遇此情况，应重新操作.另外应特别注意，不要因在下降镜头

8、时或提升载物台时用力过猛或调焦时误将粗调节器向反方面转动而损坏镜头及载玻片.（6） 显微镜用毕后的处理用粗调节器使物镜远离玻片，取下载玻片。用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许镜头清洗液擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的镜头清洗液.切忌用手或其它纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕,影响观察。用擦镜纸清洁其它物镜及目镜;用绸布清洁显微镜的金属部件。放平反光镜，把聚光镜降下，将物镜转成“八”字形,将各部分还原，归置镜箱中。10.。3。4 显微镜的维护和保养显微镜是贵重精密的光学仪器,正确的使用、维护与保养，不但观察物体清晰，而且延长显微镜的使用寿命.（1） 显微镜应

9、放置在通风干燥，灰尘少，不受阳光直接曝晒的地方。不使用时,用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来。也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱或柜内放置干燥剂。（2） 显微镜要避免与酸、碱及易挥发具腐蚀性的化学物品放在一起，以免显微镜受损。（3） 显微镜应防止震动和暴力.粗、细调节螺旋、聚光器螺旋和标本移动器等机械部分要灵活而不松动，如不灵活可在滑动部位滴加少许润滑油。（4） 显微镜的目镜、物镜、聚光器和反光镜等光学部件必须保持清洁，防止长霉。镜检时通过转动目镜、物镜及调整焦距等措施判断灰尘或污脏所在部位，如附有灰尘,则先用吸耳球吹去灰尘,或用擦镜纸轻轻擦去。若有污脏,用擦镜纸沾镜头清洗液轻轻擦拭

10、,然后用擦镜纸擦干。显微镜的金属油漆部件和塑料部件,可用软布沾中性洗涤剂进行擦拭，不要使用有机溶剂。（5） 用油镜观察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾少许镜头清洗液擦拭，最后用干净的擦镜纸擦干。11.实验报告绘出你所观察到的几种微生物形态图思考题1. 镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察，而不直接用高倍物镜或油镜观察?2. 油镜用毕后,为什么必须把镜油擦净?用过多的清洗液擦镜油有什么危害？3. 观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开?10。2 细菌的简单染色法及革兰氏染色法10。2.1 目的要求学习并掌握无菌操作技术；学习细菌涂片、染色的基本技术;掌握细菌的简单染色法和革兰氏染

11、色法；巩固显微镜（油镜)的使用方法和学习生物绘图技术。1.2 染色原理细菌个体微小，菌体透明,必需通过染色使其着色后，才能较好地在光学显微镜下观察其个体形态和部分结构。10.2。2.简单染色法利用细菌在中性环境中带负电荷，而碱性染料如结晶紫、美蓝、碱性复红、番红等解离后带正电荷，细菌与染料具有亲和力而被着色的原理,采用一种单色染料对细菌进行染色，称为简单染色法.适用于菌体一般形态的观察.1。2。2 革兰氏染色是细菌学中的一个重要的鉴别染色法.由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌分为两大类，菌体呈者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革

12、兰氏阴性菌.其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚,交联度大,类脂质含量低,经用乙醇（或丙硐）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔经缩小，通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色,结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄,类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙硐）溶解，细胞壁通透性增大,使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上红色.10.2.3 实验材料和用具1.2.3.1 菌种大肠杆菌、白色（或金黄色）葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（培养824h的斜面菌种)。应用新鲜幼龄的菌体进行涂片。0。2。3。2试剂

13、及染液（1）齐氏石炭酸复红染液：液：碱性复红03g,9乙醇10mL液：石炭酸5。0g，蒸馏水95mL将A、B二液混合摇匀过滤。(2)草酸铵结晶紫染液:液：结晶紫2。0g,95乙醇20L液:草酸铵0。8g,蒸馏水mL将A、B二液充分溶解后混合静置2h过滤使用。（3)鲁哥氏碘液:碘1g，碘化钾g，蒸馏水0mL配制时,先将碘化钾溶于10mL水中,再加入碘1g,使其溶解后，加水至00mL。（4）5乙醇（5）番红染液:。5番红的乙醇溶液m，蒸馏水10m混合过滤。10。33 器材无菌水、显微镜、擦镜纸、吸水纸、载玻片、接种环、酒精灯、石蜡油、镜头清洗液.10.2.4 实验内容及步骤1。2.4。1 简单染色

14、法操作步骤如下:(1）制片涂菌 取洁净载玻片一块将其一面在火焰上微微加热,除去油脂,冷却,在载玻片中央滴加一小滴无菌水，用烧灼冷却后的接种环从试管中取少许菌和玻片上的水滴混匀，涂布成一均匀的薄层即可。无菌操作过程见图102。接种环用后必须再次烧灼灭菌.干燥 涂布后,待其在空气中自然晾干。固定 将已干燥的涂片正面朝上，通过火焰3次，以热而不烫手为宜。固定的作用是杀死细菌;可使蛋白质凝固，并使细菌粘附在玻片上，染色时不被染液或水冲掉;增加菌体对染料的结合力,使涂片易着色.图10.2 无菌操作过程及涂片过程1烧灼接种环;2拔去棉塞;3试管口灭菌；4挑取小量菌体;5试管口灭菌;将棉塞塞好;做涂片；8烧

15、去残留的菌体(引自顾夏声等水处理微生物学。北京:中国建筑工业出版社.198）（）染色在涂片处滴加12滴染色液（石炭酸复红、草酸铵结晶紫或番红任选一种)，使其铺满涂菌的部位,染色约1mi。（）水洗斜置载玻片,倾去染液，用细水流轻轻冲去多余染料,直至流水变清为止。注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。(4)吸干用吸水纸轻轻吸去载玻片上的水珠,自然干燥。()镜检将干燥后的染色标本,先用低倍镜找到目的物，将低倍镜移开,滴加石蜡油于涂片处,用油镜进行观察。注意各种细菌的形态和细胞排列方式。用铅笔绘出细菌形态图.观察完毕,用擦镜纸将镜头上的石蜡油擦净.10.2.42 革兰氏染色法步骤（)制片以无菌操

16、作技术取大肠杆菌和枯草杆菌（或白色葡萄球菌）分别做涂片、干燥、固定。方法与简单染色相同。还可在同一载玻片上，将两种菌作混合涂片，按下述方法染色后,在镜检时便于比较。(2）染色初染 用草酸铵结晶紫染液覆盖1min，用水冲洗。媒染 用鲁哥氏碘液冲去残水，并且碘液覆盖1后水洗。脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，乙醇滴加在涂片上静置30S立即水洗。或斜置载玻片，用滴管从玻片上端滴加5%乙醇，直至流出的乙醇刚刚不现紫色立即水洗.脱色是革兰氏染色的关键,必须严格掌握乙醇脱色的程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌;而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。复染 滴加番红复染1mi后水洗并干燥。(3）镜检干燥后用油镜观

17、察时应选择薄而均匀的区域，注意染色后细菌的颜色,以单个菌体的颜色为准。菌体被染成紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌.绘出镜检细菌的形态，并注明革兰氏染色的结果。若研究工作中要确定未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作为对照。思考题1. 涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么？2. 革兰氏染色时,初染液和复染液能颠倒使用吗？3. 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪一步？为什么？4. 为什么要用培养24h以内的菌体进行革兰氏染色?5. 当你对未知菌进行革兰氏染色时,怎样保证操作正确,结果可靠?1。3 水体卫生细菌学检验10。.1培养基及其他物品的制备及灭

18、菌10.3。1。1实验目的学会玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌的准备工作；掌握培养基的配制方法；掌握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的操作方法。03.1.2基本原理正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础.由于微生物种类及代谢类型的多样性,因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序及其他的准备工作却大致相同，例如器皿的准备、培养基的配制和分装、棉塞的制作、培养基的灭菌、斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。10。3.。3实验器材(1）试剂:待配制各种培养基的组成成分，琼脂、10HCl、10%aOH、蒸馏水等.革兰氏染液。(）仪

19、器：天平、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、电冰箱。（3)玻璃器皿:培养皿、试管、150mL大试管、移液管（L和1mL）、锥形瓶（50L、00L）、100烧杯、量筒、玻璃漏斗等.(4）其他物品：药匙、称量纸、H试纸（48。）、记号笔、纱布、全脂棉花、棉线、报纸（或牛皮纸）、试管架等。以上器材均是为10.32水的细菌总数检测和1.3水的大肠菌群检测作准备。10。.1。4实验步骤:（）玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净.培养皿、试管、锥形瓶等较大的器皿可用洗衣粉或去污粉洗涤，并用清水冲洗干净;移液管先用洗液浸泡,再用清水冲洗干净。洗干净的器皿自然晾干或置入烘箱烘干备用。（2)玻璃器皿的包装培养皿的包装

20、:培养皿由一底一盖组成一套，将实验所需套数的培养皿用报纸(或牛皮纸）包好.包装后的培养皿须经过灭菌后才能使用。移液管的包装：用细铁丝将少许棉花塞入移液管的吸端，在距管口05m处构成11.5cm的棉塞（避免外界及口中杂菌吸入管内,防止菌液等吸入口中）。棉塞要塞得松紧适宜，既保证通气良好又不会滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在c宽的长纸条的一端，使管与纸条成约30。夹角，折叠包装纸包住尖端,左手压紧移液管,在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来，余下的纸条折叠打结,准备灭菌。根据实验所需，可单支也可多支包装。图10.移液管的包扎(引自钱存柔、黄仪秀。 微生物学实验教程。 北京：北京大学出版社.

21、1999）(3）棉塞制作及试管、锥形瓶的包扎:为了培养好气性微生物,需提供优良的通气条件,同时防止杂菌污染,则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉塞等.制作棉塞时,应选用大小、厚薄适中的棉花一块,用折叠卷塞法制作棉塞,见图104所示.图10.4棉塞制作过程(引自钱存柔、黄仪秀. 微生物学实验教程 北京：北京大学出版社。 1999）按管口及瓶口大小制作的棉塞，应紧贴管壁和瓶壁,不留缝隙，以防空气中的微生物沿缝隙侵入。棉塞塞得不宜过松或过紧,以手提棉塞，器皿不掉为准。棉塞的2/3应在管内或瓶内，1/3露在口外，以便拔塞。塞好棉塞后，在棉塞外包一层报纸或牛皮

22、纸（这是为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞)并用细绵线捆扎好。目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞,直接盖在试管口上,灭菌待用.(4)培养基的制备本实验要用到四种培养基：测定细菌总数用营养琼脂培养基；测定大肠菌群用乳糖蛋白胨培养基、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基。营养琼脂培养基：牛肉浸膏g，蛋白胨10 ,氯化钠5g,琼脂2g,蒸馏水10m、pH77.制备：称取各成分,放入蒸馏水中,加热溶解并补足蒸发的水分.用10aO调整p。装入锥形瓶中,塞上棉塞,包扎后待灭菌.乳糖蛋白胨培养基:蛋白胨，牛肉浸膏3，乳糖5g，氯化钠5g，.%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，蒸馏水1000L，pH7。2.4。制备:称

23、取蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠于100m蒸馏水中，加热溶解并补足蒸发的水分,用10%HCl、10%NOH调整。加入1%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀后分装于置有小玻璃倒管的试管内，每管mL，塞好棉塞、包扎。115高压蒸汽灭菌20min.三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基:除蒸馏水外，上液各成分均为三倍，制法同上,分装于置有小玻璃倒管的试管内，每管5mL；另分装于支大试管内，每管50mL.其余同上步。伊红美蓝培养基:伊红美蓝琼脂40 g，蒸馏水10mL.制备:用药物天平称取40 g伊红美蓝琼脂于000蒸馏水中，加热溶解并补足蒸发的水分。充分混匀后分装于锥形瓶中,塞好棉塞、包扎。115高压蒸汽灭菌0in

24、。（5）灭菌干热灭菌法：培养皿、移液管、试管及其他玻璃器皿可用该法。将上述物品包装好放入干烤箱中,当温度升至1后保持120 m.要注意温度不得超过1,不然包装纸会烧焦.高压蒸汽灭菌法:该法要使用高压灭菌锅.微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）都可用此法灭菌。具体步骤如下：打开灭菌锅盖，从进水杯中向锅内加入适量的水(至量高水位的标示高度)，然后把要灭菌的物品放入锅内（不要放得太紧和紧靠锅壁,以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品）,盖上锅盖，对角式拧紧螺栓，打开排气阀,关闭安全阀。通电加热，在加热过程中，不断有水蒸汽从排气阀泄出，等锅内水沸腾后，再保持35in排气时间后关闭

25、排气阀,此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽。当压力上升到所需温度时开始计时.通过调整热源,维持压力、温度。达到灭菌时间后，停止加热。等锅上压力表指示为零后,打开排气阀,卸下锅盖，取出物品。如果压力未降到零就打开排气阀，就会因锅内压力突降,使器皿中的培养基翻腾冲出，损失培养基及污染棉塞。将灭菌后的培养基置于恒温箱内，保持37作无菌培养12,若无细菌生长说明灭菌合格，放入冰箱或阴凉处备用。高压蒸汽灭菌锅种类和规格很多,以上操作步骤适用于立式高压蒸汽灭菌锅.其它种类的灭菌锅应严格按说明书操作。图0.5高压蒸汽灭菌锅构造（引自钱存柔、黄仪秀.微生物学实验教程. 北京:北京大学出版社。 199)10.

26、3。2水中细菌总数及大肠菌群的测定10.321实验目的学习水中细菌总数的测定方法；了解平板菌落计数原则；掌握用多管发酵法测定水中总大肠菌群数量的方法;了解总大肠菌群的数量在饮水中的重要性；掌握平板划线分离技术。10.2。2实验原理细菌总数（C）是指1mL水样在营养琼脂培养基中,于3培养2h后所生长的细菌菌落的总数。是应用平板计数技术进行测定的。水中的细菌总数可以作为水体的卫生状况和污染程度的指标。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多、且与多数肠道病原菌存活期相近、并易于培养、观察的一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。故被定为检验肠道致病菌的指示

27、菌，作为水体受粪便污染及其污染程度的指标。一般采用管发酵法测定。我国饮用水卫生标准规定:1mL自来水中细菌总数不能超过100个；每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。10.3.2.水样的采集和处置（1）自来水的采集：将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧510分钟灭菌，然后再放水流5分钟，以排除管道内的存水，再用无菌容器取水。如果水样中含余氯,则采样瓶在灭菌前应预加入硫代硫酸钠溶液于瓶中（每500mL水样加3%硫代硫酸钠溶液mL),以消除余氯的影响，避免其继续存在产生杀菌作用。(2）河湖水、井水、海水和其他水样的采集：可用特制的采样器.采样器的种类很多，图05是其中的一种.采样器外部是一金属框,内装玻璃瓶

28、，器底有沉坠，可按需要坠入一定的深度,瓶盖系有绳索控制瓶盖启闭,拉起绳索即打开瓶盖装水，松放绳索即自行盖上。取样前应对玻璃瓶作灭菌处理.采样时将采样器浸入水中，使瓶口位于水面下1015cm处.水样采集后,将水瓶取出待检.图10。6 采样器（引自李军、王淑莹。水科学与工程实验技术。北京：化学工业出版社02)水样采集后,迅速送回实验室进行检验.水样采集与检验间隔时间应在h以内。若来不及检验,应放在冰箱内保存.取样时要注明日期、温度、水的来源、环境状况、水的用途等。1.3。2。4 细菌总数的测定(1）自来水的测定用无菌移液管吸取1mL水样,以无菌操作方式注入无菌培养皿中。至少做3个平皿。另取一套无菌

29、培养皿，做空白对照。将10。31准备的营养琼脂培养基加热融化并冷却至45左右，以无菌操作方式倾入每皿约15mL，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀.冷却凝固后，将以上所有平板倒置于恒温箱中37培养24h,计菌落数.算出3个平板上生长的菌落总数的平均值即为1L水样中的细菌总数。（2)水源水或其他水样的测定稀释水样:在无菌操作下，以0倍法稀释水样.如取支无菌空试管，分别加入L灭菌水。取mL水样注入第一管m灭菌水内,摇匀；再从第一管中取1水至第二管，摇匀；如此稀释到第三管,则稀释度分别为101、102、103.稀释倍数视水质而定,以培养后平板的菌落数在3030个之间的稀释度最为合适.一般

30、中等污染水样，取10-、02、03三个连续稀释度.若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。接种培养:用无菌移液管吸取三个适宜浓度的稀释液1mL分别加入无菌培养皿中，每一稀释度做个平行，共个.以下操作与自来水的检测步骤相同.（3)菌落计数方法即报告方式用肉眼观察，计各浓度的2个平板的菌落总数，并计算平均菌落数。根据各种不同情况采用不同的计算方式报告结果。有以下几种情况:首先选择平均菌落数在30300之间者进行计算。当只有1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之(表101例1)。若有个稀释度的平均菌落数在3030之间时，则按两者的菌落

31、总数之比来决定，若比值小于应报告两者的平均数；若大于则报告其中较小的菌落总数（表10。例、3).若所有稀释度的平均菌落数均大于30，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表101例4）。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(表1。1例5)。若所有稀释度的平均菌落数均不在3030之间，则以最接近30或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(表10.例6)。若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。(表10.1例）在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平

32、均菌落数。若片状菌落约为平板的一半,而另一半平板上菌落分布很均匀,则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数.菌落计数的报告.菌落数在10以内时按实有数报告,大于00时，采用二位有效数字,在二位有效数字后面的位数,以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示(表0.1报告方式栏）。表0。稀释度选择及菌落总数报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（个/m)报告方式（个）0102103116516426006000或1610276025461.675038000或3。810280216022271027000或2。704无法计数450135

33、130001000或510552711520270或2.716无法计数3512350031000或3。1047无法计数无法计数无法计数-3无法计数1025大肠菌群的测定大肠菌群数的检验方法多采用多管发酵法，包括初(步)发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分.（1)自来水测定初步发酵实验在2个含有50m三倍浓缩蛋白胨发酵管（或瓶)中，各加入100m水样，在10支含有mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中,各加入10m水样，混匀后，37培养24h，2h未产酸产气的继续培养至4h。若培养基颜色由红变黄（产酸）,有产气现象或培养基由红变黄（产酸）,但无产气现象，则均为阳性反应,表明可能存在大肠菌群,水可能被粪

34、便污染，需作进一步检验。若培养基仍不变色（不产酸）,无产气现象，则为阴性反应,表明无大肠菌群存在。若培养基颜色不变(仍为红色）,但小倒管中有气体产生，溶液不浑浊，则是操作问题，应重做实验.平板分离平板的制备：将实验31准备的伊红美兰培养基加热融化,待冷却至5左右，以无菌操作方式倾入每皿约15L,一共制作3个。待其自然冷却凝固后即成平板。平板分离:经24h培养后,将产酸产气及48h产酸产气的发酵管（瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上,再将培养皿倒置于3下培养824h.平板划线方法：先将接种环放在洒精灯火焰上灼烧灭菌，然后以无菌操作,用接种环醮取初发酵呈阳性反应试管中的菌液.右手持已有菌液的接

35、种环,左手持培养皿,以中指、无名指和小指托住皿底,拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀起半开，右手将接种环伸入皿内,在平板上轻轻划线（切勿划破培养基）,划线的方式可参照图0。任选一种.图10。7平板划线分离方法(引自李军、王淑莹。水科学与工程实验技术。北京：化学工业出版社。02）将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片,革兰氏染色，镜检。深紫黑色、有金属光泽；紫黑色、不带或略带金属光泽;淡紫红色、中心颜色较深。复发酵实验经涂片、染色、镜检,如为革兰氏阴性无芽孢杆菌,则挑取该菌落的另一部分，重新接种于单倍浓度乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落13个，37培养2

36、h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。（2)水源水或其他水样的测定将水样稀释成101与10-2.分别吸取m0-、0-1的稀释水样和1mL原水样，各注入装有1L单倍浓度乳糖蛋白胨发酵管中.另取10mL和100mL原水样,分别注入装有5m和5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管(瓶）中。以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。(3)大肠菌群测定结果自来水测定再根据初发酵试验的阳性管(瓶)数查表1.,即得大肠菌群数。表102 大肠菌群检数表接种水样总量300mL(10份，mL10份）00L水量的阳性管数L水量的阳性管数12每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数03411

37、131827132711134124525183706223927274120835161936602301006930水源水或他水样 如取样量分别为10、10、1、0。1(01）mL的发酵管,其结果则查表10.3；如取样量分别为10、1、0。1(101)、0.01(10-)mL的发酵管,其结果则查表.4，即得每升水样中的大肠菌群数。表0。 大肠菌群检数表接种水样总量11。1m（10m、1mL、1m、0。mL各1份）接 种 水样 量/mL每升水样中大肠菌群数10010.1-238“”大肠菌群发酵阳性；“大肠菌群发酵阴性.表1。4 大肠菌群检数表接种水样总量1111L（10、1、0。1、0。01

38、L各1份）接种 水 样 量mL每升水样中大肠菌群数01.0。01280“”发酵阳性；“发酵阴性。10。3。 实验报告将测定结果填入下列表5中。表0.5 水样测定结果报告水样1mL水中细菌总数1水中大肠菌群自来水水源水或其他水样思考题：1. 培养基配制好后，为什么必须马上灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？2. 如何检验培养基灭菌是否彻底?3. 测定水中大肠菌群数有何意义？为什么选用大肠菌群数作为检验指标？4. 从自来水的细菌总数结果来看,是否合乎饮用水的标准？5. 所测的水源水或其他水样的污染程度如何？104 微生物对有机物降解与转化能力的定性分析14.1 目的要求了解细菌对常见有

39、机物的降解与转化能力及其原理；了解不同种类的细菌对不同的生物大分子的分解利用情况，从而认识微生物代谢类型的多样性；学习并掌握物理诱变育种的方法；熟悉平板接种法。1。4.2 基本原理大分子有机物不能被微生物直接吸收，它们须经微生物分泌的胞外酶将其分解为小分子有机物，才能被吸收。不同微生物分解利用生物大分子能力各有不同，只有那些能够产生并分泌胞外酶的微生物才能利用大分子有机物。由于各种微生物的新陈代谢不同，因此对各种物质利用情况或产生的代谢产物不同,故可利用化学反应来测定微生物的代谢物(这种反应称为生化反应）,并以此作为鉴定微生物的依据。现分别介绍淀粉水解、油脂水解、牛乳分解、蛋白质分解等试验的简

40、单原理。0.3 实验材料1.。3.1 菌种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粘乳产碱菌、铜绿假单胞菌。0.3.2 培养基（1） 淀粉培养基: 蛋白胨10，aC 5 g,牛肉膏5g，可溶性淀粉2 g,琼脂120 g,蒸馏水L，7。2，12灭菌20m.（2） 油脂培养基:蛋白胨10g，NaCl 5，牛肉膏,香油或花生油10g，中性红(1.6%水溶液）约0mL,琼脂152g，蒸馏水1000mL，pH.2，1灭菌20mn。（3） 石蕊牛乳培养基:葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HO4 5，蒸馏水 00,pH 7。274,灭菌0mi。（4） 蛋白胨水培养基:蛋白胨10g，NCl 5g，蒸馏水100L,

41、 7。,1灭菌2mn.143。3 试剂碘液：同革兰氏碘液吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛2，5乙醇190m，浓盐酸4L。乙醚144 其他物品无菌培养皿、无菌试管、接种环、涂布棒、酒精灯、电磁搅拌器、紫外灯、黑布、尺子等。104. 实验内容10。44 淀粉水解试验用紫外线对枯草芽孢杆菌进行诱变,产生淀粉酶,将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后遇碘不再变蓝色。操作步骤如下:（1）诱变菌悬液的制备取已培养20h的活化枯草芽孢杆菌斜面一支,用10mL生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡1n，以打破菌块,0rmi离心5n,弃上清液，将菌体用生理盐水洗涤2次，最好制成菌

42、悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108个/mL。平板制作 将盛有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，然后取出冷却至45左右，以无菌操作倾入培养皿中约20m，待凝固后制成平板。诱变处理 紫外灯（20w）开启预热10in，把取制备好的菌悬液4mL移入直径6cm的无菌培养皿中,加无菌磁力搅拌棒、放在磁力搅拌器上搅拌，并置于紫外灯下30进行照射处理，时间分别为min、2min、3min。所有操作必须在红灯下进行.稀释涂平板 在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照）和照射过的菌悬液各0.5mL进行不同程度的稀释。取最后3个稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个稀释度涂个平板，每个平

43、板加0。1mL，用无菌玻璃棒涂均，37培养48（用黑布包好平板).注意，在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。（2）计算存活率及致死率将培养48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1m菌悬液中的活菌数。存活率处理后1mL菌液中活菌数对照1mL菌液中活菌数100同样计算用紫外线处理1、2、min后的存活细胞数及致死率。致死率对照1mL菌液中活菌数处理后1mL菌液中活菌数对照1mL菌液中活菌数100（3)观察诱变效应在平板菌落计数后,分别向菌落数在56个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈,则说明淀粉已被水解，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值（HC值）

44、，与对照平板进行比较，根据结果说明紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶诱变的效果。10。44.2 油脂水解试验某些细菌能够分泌脂肪酶（胞外酶)，能将培养基中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。所产生的脂肪酸，可通过预先加入油脂培养基中的中性红加以指示指示范围H6。8(红）8。0（黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，培养基出现红色斑点。 操作步骤如下： （1)将装有油脂培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化,取出并充分振荡(使油脂均匀分布），再倾入培养皿中，待凝固后制成平板。(2）翻转平皿使底朝上，用记号笔在其背面玻璃上划成两半。 (3）用接种环在平板的一边划线接种金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌，另一边接种大肠杆菌或产气杆

45、菌，然后将培养皿在7恒温箱中倒置培养24h。（4）观察结果时,注意观察平板上长菌的地方,如出现红色斑点,即说明脂肪已被水解，此为阳性反应。1。4.4 石蕊牛乳试验牛乳中含有乳糖和酪蛋白。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖和酪蛋白的分解利用。牛乳中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色,碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部褪色变白。细菌对牛乳的作用有以下几种：（1） 产酸 细菌分解乳糖产酸,使石蕊变红。（2） 产碱 细菌分解酪蛋白产生碱性物质,使石蕊变蓝。（3） 胨化 细菌产生蛋白酶,使酪蛋白分解，故牛乳变成清亮透明的液体。（4） 酸凝固 细菌发酵乳糖产酸，使牛乳变

46、红，当酸度很高时，可使牛乳凝固。（5） 凝乳酶凝固 细菌产生凝乳酶,使牛乳中的酪蛋白凝固，此时石蕊呈蓝色或不变色.（6） 还原 细菌生长旺盛时,使培养基氧化还原电位降低，因而石蕊被还原而褪色.操作步骤如下:（1）分别接种粘产碱菌或铜绿假单胞菌于二支石蕊牛乳培养基中,置于37恒温箱内培养7d.另外保留一支不接种的石蕊牛乳培养基作对照。（)观察结果时,注意牛乳有无产酸、产碱、凝固或胨化等反应。注意牛乳产酸、产碱、凝固或胨化各现象是连续出现的，往往观察某种现象出现时,另一种现象已经消失了。0.44.4 吲哚试验有些细菌能氧化分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚无色,可与对二甲基氨基苯甲醛结合,生成红

47、色的玫瑰吲哚。操作步骤如下:(1）以无菌操作分别将产气杆菌和大肠杆菌接种在蛋白胨水培养中，置于37恒温箱内培养8.（）观察结果时，在培养液中加入乙醚2mL（使呈明显的乙醚层）,充分振荡,使吲哚被溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上层，然后沿试管壁加入0滴吲哚试剂，如果有吲哚产生,则乙醚层呈现玫瑰红色（注意:加入吲哚试剂后，切勿摇动，否则红色不明显)。04。5 实验报告10。4。5.1淀粉水解试验结果表10。6 紫外线处理后枯草芽孢杆菌的平均菌落数和存活率及致死率紫外线处理（min)稀释度存活率（）致死率(）对照123表10。7 透明圈和菌落直径大小及HC比较紫外线处理(min）134透

48、明圈菌落大小C比值透明圈菌落大小H比值透明圈菌落大小C比值透明圈菌落大小HC比值透明圈菌落大小H比值123对照10。5 其他几种试验结果表10。8 几种试验结果菌种油脂水解试验石蕊牛乳试验吲哚试验大肠杆菌产气杆菌金黄色葡萄球菌粘乳产碱菌铜绿假单胞菌未知菌“”表示阳性反应，“”表示阴性反应。思考题：1. 淀粉、油脂、酪蛋白等大分子物质能否不经分解而直接被细菌吸收？为什么?2. 紫外线诱变须注意的事项是什么？3. 在吲哚试验中，细菌分解何种氨基酸？.5 微生物对有机物降解与转化能力的定量分析微生物具有降解和转化有机物的巨大潜力.本实验通过几种微生物对苯酚的转化，具体认识微生物在降解有机质、清除环境

49、污染物中的作用。10。5。目的要求学习从含酚工业废水、活性污泥中分离、纯化和筛选苯酚降解菌;学会耐酚菌对苯酚降解能力的测定。0。52 基本原理 酚类化合物是化工、钢铁等工业废水的主要有毒成分。某些耐酚的假单胞菌和假丝酵母能在含酚废水的活性污泥中生长,具有较强的降解苯酚能力.苯酚经微生物体内单加氧酶氧化转变为邻苯二酚，细菌中邻苯二酚大多数邻位裂解途径进行,生成酮己二酸后，最终生成乙酰A和琥珀酸，再进一步通过三羧酸循环氧化成CO2和H2O。10.5.3 材料与试剂105.3培养基 （)耐酚真菌培养基(液体、固体斜面)：葡萄糖2g，酵母膏0。5g，马铃薯汁20mL,微量元素溶液10m，苯酚255mg

50、，蒸馏水70m，H56，12灭菌20min。固体培养基加20琼脂。（2）耐酚细菌培养基（液体、固体斜面）:在00mL锥形瓶中装6。6m的肉膏蛋白胨培养液，灭菌后加入5m苯酚溶液（6gL).每支固体斜面中加4m苯酚溶液（6g/L）.（3）苯酚无机培养基：苯酚5mg(或00或2mg）,gO423g,KP 03,蒸馏水100mL,pH 7.2,21灭菌0in。（5） 碳源对照培养液A:葡萄糖m5g（不同浓度），尿素0。1g,微量元素溶液10mL，p7。2，121灭菌20mn.（6） 苯酚培养液：苯酚5g7m(不同浓度）,尿素0。g,微量元素溶液10L，H 7.07.2,21灭菌20mi。.。3。2

51、试剂（1） 微量元素溶液：MO47H2 03g,KH2PO 0.3g,eS47 0。5g,CaCl20005,以上药品溶于00mL蒸馏水中。（2） 酚标准贮备液:精确称取精制酚100g溶于无酚蒸馏水中，稀释定容至1000mL,贮于棕色瓶中，放置冷暗处保存。此1液mL相当于1m酚，因为在保存中酚的浓度易改变，故标定其浓度。见附注1。（3） 酚标准使用液:吸取酚贮备液0.mL,用无酚蒸馏水稀释定容至00mL,则1mL。m酚,再吸取此液0。00mL，用无酚蒸馏水稀释定容至100m,则1mL=0。001mg酚.此溶液临用临配。（4） 无酚蒸馏水的制备：测酚所用的蒸馏水,必须不含酚和氯。在普通蒸馏水中，

52、以100mg/L的比例加入粉末状活性炭，充分摇匀后,用定性滤纸过滤即得。（5） 24氨基安替比林溶液:称取2g 4-氨基安替比林，溶于蒸馏水中,定容至10L,贮存于棕色瓶中，此液只能保存1周，最好临用临配。（6） 氯仿（7） 20氨性氯化铵缓冲液(pH。8)：称取0g 分析纯的NH4C,溶解于浓氨水中，用浓氨水定容至100mL，此液pH9。8,贮存于具橡皮塞的瓶中，在冰箱中保存。（8） 0.100mo/L溴化液：称2784g干燥(180烘干后置干燥器内)的分析纯溴酸钾及0g分析纯溴化钾，溶于蒸馏水中，并定容至00mL。（9） 0.1000moL/L硫代硫酸钠溶液:称取24.8g分析纯Na2O3

53、5H2溶于煮沸放放冷却的水中，定容至00mL,用前用0500重铬酸钾标定。见附注2。（10） 1淀粉溶液:称可溶性淀粉，用少量水调成糊状，加沸水至000mL，冷却后冰箱保存.0。3。 其他物品无菌水、无菌培养皿、无菌移液管等;试剂瓶、容量瓶、移液管、酸式滴定管等。10。5。4方法与步骤105。4.1采样自焦化厂、钢铁公司化工厂处理含酚工业的曝气池中取活性污泥和含酚废水，装于无菌锥形瓶中,带回实验室.记录采样日期、曝气池的水质分析（包括:挥发酚、可溴化物、BO5、CO、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等）。采回的样品应迅速稀释分离.15.4。2 梯度平板法分离纯化一般微生物在含

54、酚培养基上不能生长，苯酚耐受菌株的筛选，可采用与筛选药物抗性菌株一样的梯度平板法。即在培养基中加入一定量的药物，使大量细胞中的少数抗性菌细胞在平板上的一定剂量药品的部位长成菌落,从而判定该菌耐苯酚的能力。（1） 梯度平板制备在已灭菌的培养皿中，先倒入710mL不含苯酚的已灭过菌的细菌或真菌培养基，将培养皿一侧放置木条上，使皿中的培养基倾斜成斜面，而且刚好完全盖住培养皿底部,待培养基凝固后，将培养皿放平,再倒入7m已融化的无菌耐酚细菌或真菌培养基（苯酚终浓度为5mg/100mL)，刚好完全盖住下层斜面，由于苯酚的扩散作用，上层培养基薄的部分苯酚浓度大大降低，造成上层培养基由厚到薄苯酚浓度递减的梯

55、度（见图10。8)。图10。8 梯度平板制备及菌落生长情况（引自钱存柔、黄仪秀.微生物学实验教程北京：北京大学出版社 1999)（2） 涂布法分离将采集的样品进行稀释涂布分离，0培养2后,平板上生长的菌落也形成密度梯度，上层培养基薄的部分苯酚低浓度区形成菌落多，上层培养基后的部分苯酚高浓度区出现稀少菌落。将此菌落在耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上,3培养d。0.5。.3 耐酚菌驯化先将从含酚工业废水采集来的活性污泥，放入苯酚无机培养液中(苯酚终浓度5g/、MSOO终浓度。3,2O4终浓度03%），0培养10d，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微

56、生物；再添加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至100mg/L）,30振荡培养6d；再流加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至2g/L)30振荡培养6d,再提高到流加25mg/L苯酚无机培养液，3振荡培养4后从中选出对苯酚耐受力强的苯酚降解菌。1。5。4. 性能测定（1） 初筛制备不同浓度苯酚含量的平板培养基(苯酚终浓度依次为:。025、0%、.0、075%),将选出的耐酚力强的菌株在其上分别划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为苯酚降解力高的菌落.（2） 复筛将经初筛纯化的菌种，分别接入碳源对照培养液和苯酚培养液B中，30振荡培养4h，于发酵的0、1、4、36、48取样,在O60处检测光密度值（O）,或采用比浊法在浊度计上测定混浊度。绘制在葡萄糖培养液和苯酚培养液中的生长曲线，在50mg/L苯酚培养液中生长速度下降不明显者为耐酚菌株。按下述方法测定接种前和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算苯酚降解率。若苯酚降解率大于80，表明确为有效的苯酚降解菌。