高效液相常见问题

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1、摘自丁香园请问：我的柱压为什么一直很高？每天做完后我用于5%的甲醇0.2ml/min冲过夜，第二天 用甲醇冲30min后再进行工作。答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身 的问题，我建议你可按下面步骤检查问题的起因。1、拆去保护柱（哪个是保护柱？，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高， 再检查；2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再 检查。3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接 检测器，以防固体颗粒进入检测器）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4、更换柱子

2、入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将 筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与柱子厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱 之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题。我看到你用5%的甲醇0.2ml/min冲过夜，虽然流速很低，但你的水相占比例大，对柱子的 寿命不好，不知道你的是长柱还是短柱，柱压有多高？请告知！请问：做HPLC时，基线漂移厉害是怎么回事？做 HPLC 时，不进样，走梯度，0-20min,20%CH30H-100%CH30H, 20-30min,100%CH30H,用 H20 /CH3OH,或0.1%TFA/CH30H,0.1%TFA体系，波长240

3、nm,基线漂移的厉害，大概漂移有200MA U,是不是进样池污染了？答： 1进气泡了,流动相脱气2如果是检测池污染了.在不接柱的情况下，先用水冲20min,然后用5%的硝酸冲洗30min,最 后用水冲洗至中性.1. 检测池可能有气泡2. 检测池可能被污染3. 检测池流动相未置换完全4. 氘灯问题。5. 色谱柱污染6. 脉动7. 温度影响HPLC常见问题和对策一对实验人员十分有用HPLC 色谱常见问题1用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？2. 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？3. HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法4做HPLC分析时，柱

4、压不稳定，原因何在？如何解决？5我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不重现，为什么？6我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？7. 色谱双峰产生的可能及判断和处理8. 色谱柱中的流动相会排干吗？9. 使用PEEK (polyetheretherketone)管路和接头需要注意什么问题?10. 液相色谱梯度洗脱中柱温的影响有那些？11. 为何基线会漂移12. 规则的基线噪音是如何产生的13. 不规则的基线噪音是如何产生的14. 保留时间漂移的故障排除15. 为何出现肩峰或分叉?16. 为何出现鬼峰?17. 为何出现峰拖尾?18. 为何出现峰展宽?19. 除了

5、流速外，还有哪些因素能引起压力改变?20. 什么是强溶剂、弱溶剂?21. 怎样才会使峰位发生重排?22. 除了在线脱气常用的实验室脱气方式还有哪些?23. 评价一个色谱柱的最基本指标有那些?24. 什么是时间常数?25. 为什么在实验过程中有时会出现倒峰?26. 为何会出现“胖峰和平头峰?怎样避免?27. 什么是次级保留效应?28. 前延峰的发生及处理?29. 峰变宽的原因?30. 柱平衡慢的常见原因有哪些?31. 用内标法实验时对内标物的要求有哪些?32. 管子切割与安装注意事项?33. 什么是HPLC的“无限直径效应？34. 如何评价一台检测器?35. 如何简单判断比例阀是否内漏？1. 用

6、HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决? 关于漂移问题： 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。 流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合2. 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？ 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的

7、柱子 可能柱超载，减少进样量。3. HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 样品量不足，解决办法为增加样品量 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器 检测器衰减太多。调整衰减即可。 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数？ 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。 检测池中有气泡。解决办法为排气。 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。 流动相流量不合适。调整流速即可。 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。4. 做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？ 泵内有空气，解决的办

8、法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理； 比例阀失效，更换比例阀即可； 泵密封垫损坏，更换密封垫即可； 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法； 系统检漏，找出漏点，密封即可； 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。5. 我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但 不同的厂商的 ODS 填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被 分析物中的各组分在不同牌号的 ODS 柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如

9、三 乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重 现性。如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。6. 我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可 按下面步骤检查问题的起因。 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查； 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查； 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10 倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，

10、以 防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引 起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避 免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。7. 色谱双峰产生的可能及判断和处理HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下（不 包括梯度），峰型应对称而尖锐。但是，在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合 理下，会出现各种意

11、想不到的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此。下面根据 本人几年工作的体会，提出一些看法，向同仁指教。色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。1 色谱柱如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采用单一纯物 质时，可以肯定色谱柱出问题柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来色谱柱正常，色 谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗 或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也 会

12、正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这是可以将进样那头拧 开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不 能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。2 溶剂极性及进样量许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这确 是双峰产生的一个很重要的原因。目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添 加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多 情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、

13、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样 品进样量大，如定量管为20ul,此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小（每次都 不太一样），且拖尾，保留时间会提前（相对进样量少而言），将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这 是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双 峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐 高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色谱柱问题）。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大， 色谱柱过载造成的。3 样品的特性 有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构

14、现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态 平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖 尾，条件稍一变化，尤其pH,双峰现象将消失，如红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在 LC-MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如我分析过的农药啶虫眯（吡虫清）。4参数记录的参数一般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的参数是不完全一致的，例如C-R3A 数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms，HPLC为5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。8. 色谱柱中的流动相会排干吗？不少做色谱分离试验的人遇到过这样的

15、情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了， HPLC 系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？ 色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满 了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同 样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶 剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完 全

16、脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润 填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以 1mL/min 的流速） 冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。9. 使用PEEK （polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便 与不同品牌或规格的色谱柱相连接。使用此类材料的管路需要注意的是：PEE

17、K对卤代烷烃和四氢咲喃的兼容性不好。虽然未观察到上述 溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈 钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。 使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK 接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。10. 液相色谱梯度洗脱中柱温的影响许多色谱工作者在操作液相色谱时，色谱柱是在室温环境下工作的。如果实验室的温度能保持不变的 话，不会有什么

18、大问题。但大多数的工作环境温度是不断变化的，因此若想将在某实验室开发的一种液相 色谱方法应用到其他实验室的话，温度的差别就会引起较复杂的问题。温度的影响在所有的色谱分析方式 中都是存在的，本文就来讨论液相色谱方法中的梯度洗脱方式受温度影响的问题。等度保留大多数色谱工作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。图1 显示了三个不同温度下的分离结果。我 们发现当温度升高时所有的色谱峰都前移了，等度洗脱时一般温度每升高一摄氏度保留时间会缩短 1-3%， 在图1中，保留时间变化率约为2%/C。拥有温控系统的实验室一般都有全天候温控设置，但这种设置可能引起室温显著变化，这对整夜运行 的色谱系统就会有一些影响，

19、例如我们实验室的夜间温度就设为4-7Co在不同的季节，实验室的夜间温度 可能比正常工作日的温度高或低，这种温度的变化就会使色谱峰离开“保留时间窗，造成连续进样中产生 一系列的无效数据。 还有一个可能的温度影响因素就是色谱仪器在实验室的位置。当色谱柱正对着空调的送风口时，虽然 整个实验室的温度非常稳定，但色谱系统的温度就会不断的变化。这就是我们要使用柱温箱的原因之一。梯度保留温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。图 2是苯胺和苯酸在三个温度条件下的色谱图。 图1中，20C的温度变化引起保留因子的变化大约为两倍，然而在图2中，40C的变化使保留改变了约20%。 平均来说，图2中的色谱保留

20、变化约为0.2%/C。由此可见，温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱 的影响（假定本例具有普遍代表意义）。即便如此，若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值一般都会有较大 的变化。选择性的变化比较图1和图2会发现温度变化能引起选择性显著变化。图1中，25C时第二个峰和第一个峰很接近, 但当温度升高后，第二个峰却远离第一个峰，接近第三个峰。从三个图来看，对于前三个峰的最佳分离条 件是35C。值得注意的一个有趣现象是，选择性的变化是和成分相关的，例如图1中当温度变化后最后三 个峰的相对位置几乎不变。在图2的梯度洗脱示例中，也有选择性变化。峰1、2、4和5的相对位置没有十分明显的变化，但是， 当温度升

21、高时，峰 3 会移近峰 4。 峰位置的相对变化和温度的变化是有规律可循的。当条件确定以后，这个规律就是可预测的。例如，在图 2中当温度升至77C以上时，峰3和峰4将会合并。而当温度更高时，峰3将会移到峰4之后。温度引起 的选择性变化的多年来一直未受重视。最近，施耐德等人发现能够将温度作为一个调整选择性的有力工具。 图1中的样品在35C时可以达到最佳选择性（峰之间的距离最大），而图2中的样品在38C时可达到最佳选 择性（这两份样品的最优温度近似纯属巧合）。温度控制从实践出发，图 1 和 2的例子说明为了获得一致的结果我们必须要控制柱温，使用柱温箱是最好的办 法。目前商业化的柱温箱有两种形式：直接

22、加热色谱柱和通过空气传热，每种设计都有其优缺点，而且不 同厂商设计的 LC 系统也有不同的限制。在直接加热型柱温箱中色谱柱是被夹在金属加热器中或被加热器 包裹起来；而在空气传热型的柱温箱和气相色谱柱温箱很相像，色谱柱是被悬挂在静止或流动的空气中， 通过加热空气来保持柱温。第三种设计是把色谱柱浸在液体中（比如水浴中），这在实验室中很容易搭建， 但通常这种设计也并不比其他设计省力。如果没有柱温箱，最有效的办法就是将色谱柱隔绝在一个温度波动最小的地方。例如，可把色谱柱置 于泡沫塑料套中或色谱包装盒中，当实验室温度基本不变时效果很好，但这种方法必须要允许保留有一些 波动。隔绝色谱柱也可以避免结果受环境

23、温度影响。温度平衡我们知道，为了保证分离的重现性，色谱柱在梯度洗脱状态下的必须有平衡过程。当一次梯度洗脱分 离完成后，一定要用 10-15 倍柱体积的流动相来冲洗柱子以恢复柱子的平衡。例如，如果使用 B 溶剂 5-100% 的梯度，柱子为150mm?4.6mm（柱体积为1.5ml）,当流动相从100%的B溶剂换回到5%的B溶剂时，大概 需要保持1.5ml/min的流速10分钟来恢复系统平衡，在进行下一次梯度变换之前如果系统没有平衡,那么保 留时间的重现性就会很差。正如柱子不能完全平衡将导致保留时间的重现性差一样，柱温不平衡也会导致不理想的后果，这个问 题在峰宽上的影响尤其明显。当温度变化时除了

24、选择性和保留时间的变化之外，峰宽也会发生变化。升高 温度通常会使理论塔板数（N）升高，峰宽变窄，由于峰面积不变，峰越窄就会越高，因此升高温度可以达 到更小的检测限。（这篇文章里的色谱图不是按同一个 y 轴比例来画的，所以峰高的变化没有表示出来）不用平衡的流动相充分的冲洗柱子会导致化学不平衡状态，但是当柱子在程序升温的环境中我们怎样 确定不平衡问题呢？答案取决于柱子中的流动相，如果柱子是在室温条件下，溶剂瓶、泵和自动进样器也 在室温下，那么整个系统中的温度就应该是稳定的。但是，如果柱子是热的，系统的其他部分和溶剂是室 温，柱头将比柱尾凉。柱子里的温度变化将会影响峰形。图3所示色谱图中柱温为38C

25、,进柱的溶剂为室温（约22C）,最后一个峰有很明显的变形。把溶剂瓶、 泵、自动进样器加热至与柱温相同是不现实的，所以溶剂预热器是最好的选择。我们用1米长，0.25mm内 径的不锈钢管作为预热器，把这个不锈钢管盘成直径大约10cm的平面紧贴在柱温箱里的预热器上，再让 流路垂直以便预热器能够位于自动进样器和柱子之间，这样，凉的溶剂从自动进样器里出来到柱子之前经 过这个预热盘升高了温度。图 3 中的上面一个色谱图就是增加了预热器使峰形得到改善。有一些商品柱温 箱就包括这个预热器。当流动相和柱子之间的温差增大时，由温度不平衡而导致的峰变形就会加剧。比较图3-5你会发现这 个问题很富戏剧性。在77 C时

26、后一个峰变形很大以至于会认为它是两个成份或者认为柱子有了死体积。在 上述情况下当使用了预热盘以后峰型都变得很漂亮。虽然由于比例不同我们无法看出，其实图3-5中所有 对应成份的峰面积都是不变的。为什么会看到这些峰变形了呢？这很容易从峰展宽的角度来解释。前段的温度比尾部的温度高，所以 前段走的快。当前面比后面走的快的时候就会产生展宽的峰。这种现象和梯度洗脱中有种情况是相对的， 就是在一开始使用弱极性溶剂小流速后用强极性大流速。虽然使用预热器来改善峰形是一个很著名的结论 （见参考文献 3）但峰变形的原因仍然很复杂。在理想梯度洗脱中，每个峰都应该在相同的环境中出来而且 以相同的速度通过柱子，最后得到相

27、同的峰宽。但是很奇怪后出的峰变形问题比先出的峰要严重，正如图 4 所示。或许读者对这个现象会有简单的解释。结论我们发现柱温在液相色谱梯度洗脱过程中扮演了一个重要的角色，首先，提高柱温可以缩短保留时间， 其次，我们看到柱温还可以影响选择性，最后，温度的不平衡会导致峰扭曲变形。这些提醒我们，如果想 得到稳定可靠的分离结果，色谱柱的温度变化是不可忽视的。11. 为何会基线漂移原因 柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较 低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。） 流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。） 流通池被污染或有气体

28、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线） 流动相配比不当或流速变化 柱平衡慢，特别是流动相发生变化时 流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 样品中有强保留的物质（高K直）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。 使用循环溶剂，不提倡。未调整检测器。 检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法 控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器 使用 HPLC 级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用在线脱气或氦 气脱气。 用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸） 取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

29、 更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。 用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。 使用离子对试剂、缓冲盐更应注意平衡柱。 检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂 改变分析条件。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。 重新设定基线。使用新的流动相。 将波长调整至最大吸收波长处。重选检测波长。12. 规则的基线噪音是如何产生的原因 在流动相、检测器或泵中有空气（尖锐峰） 漏液 。 流动相混合不完全 。 温度影响（柱温过高，检测器未加热） 在同一条线上有其他电子设备（偶然噪声）

30、 泵振动 。解决方法 流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。 检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。 用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂 减少差异或加上热交换器 断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。采用精密级稳压电源。 在系统中加入脉冲阻尼器13. 不规则的基线噪音是如何产生的原因 漏液。 流动相污染、变质或由低质溶剂配成 流动相各溶剂不相溶 检测器/记录仪电子元件的问题 系统内有气泡 检测器内有气泡 流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。） 检测器灯能量不足 色谱柱填料流失或阻塞 流动相混合不均匀或混合器工

31、作不正常解决方法 检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通 池是否漏液。 检查流动相的组成。 选择互溶的流动相 断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。 用强极性溶液清洗系统 清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器 用 1N 的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 更换灯 更换色谱柱 维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置14. 保留时间漂移的故障排除保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向 发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。

32、 如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间 漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所 致）等。保留时间漂移的几种最常见的原因如下：一 色谱柱平衡如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20 个 柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。二 固定相稳定性固定相

33、的稳定性都是有限的，即使在推荐的 PH 范围内使用，固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质 在 pH4 时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团 配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解， 如氨基键合相等。三 色谱柱污染保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过 滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器 密封垫，以及样品等。通常

34、通过实验可判断污染的来源。样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水 样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后 会有反压的增加。可以通过使用固相提取（SPE）等样品前处理方法来去除样品基质的影响。避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去 除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。 如 THF 可去除反相色谱柱

35、中的许多污染物，但蛋白在 THF 中就不能溶解。 DMSO 常常用于去除反相色谱 柱中的蛋白。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。四 流动相组成流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动 相等。五 疏水坍塌当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近 100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失 及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面 而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。色谱柱 长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性

36、基团的反相色谱柱（如 Waters SymmetryShield RP 色谱柱）或非端 基封口的色谱柱（如 Waters Resolve 色谱柱）也可避免发生坍塌。（一）保留时间变化 柱温变化柱恒温 等度与梯度间未能充分平衡至少用10 倍柱体积的流动相平衡柱 缓冲液容量不够一一用25mmol/L的缓冲液 柱污染每天冲洗柱 柱内条件变化一一稳定进样条件，调节流动相 柱快达到寿命采用保护柱（二）保留时间缩短 流速增加检查泵，重新设定流速 样品超载降低样品量 键合相流失流动相 PH 值保持在37.5;检查柱的方向 流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度增加柱恒温（三）保留时间延长 流速下降一一管路

37、泄漏，更换泵密封圈,排除泵内气泡 硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂，如加三乙胺，或采用碱至钝化柱 键合相流失 同前（二）3 流动相组成变化一一同前（二）4 温度降低一一同前（二）515. 为何出现肩峰或分叉？ 样品体积过大用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15% 样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂 柱塌陷或形成短路通道一一更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 柱内烧结不锈钢失效一一更换烧结不锈钢,加在线过滤器，过滤样品 进样器损坏更换进样器转子16. 为何出现鬼峰？ 进样阀残余峰一一每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 样品中未知物处理样品 柱未平衡一一重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是

38、离子对色谱） 三氟乙酸（TFA）氧化一一每天新配，用抗氧化剂 水污染（反相）一一通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水17. 为何出现峰拖尾？ 柱超载一一降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 峰干扰清洁样品，调整流动相 硅羟基作用一一加三乙胺，用碱致钝化柱,增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值，纯化样品 柱内烧结不锈钢失效一一更换烧结不锈钢,加在线过滤器，过滤样品 柱塌陷或形成短路通道一一更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 死体积或柱外体积过大一一连接点降至最低，对所有连接点作合适调整，尽可能采用细内径的连接管 柱效下降一一用较低腐蚀条件,更换柱，采用保护柱18. 为何出现峰展宽？ 样

39、品体积过大用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15% 在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散 数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于 10 点 检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的 10% 流动相粘度过高一一增加柱温，采用低粘度流动相 检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器 保留时间过长一一等度洗脱时增加强溶剂含量，也可用梯度洗脱 柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小 样品过载进小浓度小体积样品19. 除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？改变流动相组成和温度；改变柱长、柱内径和填料粒度；柱突然阻塞压力升高（正常情况下其它条件不 变柱压都是逐渐升高的）。20.

40、 什么是强溶剂、弱溶剂？改变流动相的组成或溶剂溶剂强度就可以改变峰容量因子和保留时间。在一定条件下，减少保留时间 或缩短分析时间的溶剂为强溶剂，增加保留时间或延长分析时间的溶剂为弱溶剂。21. 怎样才会使峰位发生重排？在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的 保留时间，不会发生峰位的重排。下列条件改变可能发生峰位重排：流动相中换了强溶剂；PH值的改变；柱填料的改变；柱温的改变； 流动相的组成改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）。22. 除了在线脱气，常用的实验室脱气方式还有哪些？加热回流脱气，脱气效果最佳，但无法保持；氦脱气，此方法脱气效果佳，能

41、除去百分之九十以上的 空气，但氦气价格太贵，所以用的不多；真空脱气，效果仅次于氦脱气，但脱气过程中容易造成样品溶液 挥发损失；超声脱气，只能脱去约百分之三十的空气，但在实验室中最常用。目前还是尽量争取用在线脱 气，方便且效果好。23. 评价一个色谱柱的最基本指标有那些？评介一根色谱柱的基本指标是：塔板数、峰不对称因子、柱压降、适用范围和键合相浓度以及峰容量。24. 什么是时间常数？时间常数实际上是响应时间的设定，起着过滤噪音的作用。时间常数太小（太快）可能增加短噪音，时 间常数太大（太慢）可能出宽峰、拖尾峰。25. 为什么在实验过程中有时会出现倒峰？所用的流动相在检测波长下有吸收，而进在此波长

42、下没有吸收或吸收低于流动相的溶液，在流动相中 会出现洞穴，通过柱后出现倒峰。26. 为何会出现“胖峰和平头峰？怎样避免？用比流动相强度大的大体积样品进样，通常会损害色谱图的质量，而出现“胖峰和平头峰。应遵循下 列规则选用溶剂溶解样品：A最好用流动相溶解样品进样。B用大体积弱溶剂溶解样品，如反相色谱中用 水溶解样品进样，主要缺点是每次进样后在色谱图的开头出现大的负峰，有时还波及到样品峰。 C 需要时 用强溶剂溶解进样。27. 什么是次级保留效应？在良好的色谱分离中，样品分子是以单一的保留过程被保留。如在反相色谱中，溶质与柱填料的非极 性烷基链发生疏水性相互作用。但在以硅胶为基质的填料中，有些样品

43、组分能与硅醇基团相互作用，脱附 的过程很慢，使峰严重拖尾，这就是次保留过程。对付次保留效应最有效的方法就是选用封尾更好色谱柱 或加入流动相改良剂（也叫扫尾剂）。28. 前延峰的发生及处理？因柱温问题很易引起前延峰，有些样品在常温下分离可见前延峰，提高温度后前延峰的现象消失。在 离子对色谱中，前延峰的另一个原因是用非流动相作样品溶剂。因此在离子对色谱中要求仅用流动相溶解 样品，而且进样量不要太大，否则会导致前延峰或其它问题。在RP-HPLC中样品溶液的强度大于流动相引 起前延峰。增加流动相的强度，减少样品溶液的强度，在离子对色谱中增加离子强度，可以克服前延峰的 效应。此外使用流动相溶解样品是解决

44、的最简单实用的方法。29. 峰变宽的原因？A 在使用过程中柱本身退化，逐渐降低柱效。 B 柱外峰宽效应。一根很好的专用柱用于另一液相色谱 系统引起塔板数降低，说明新系统有很大的柱外峰宽效应。C化学效应，多数是流动相和固定相相互作用 所致，改变流动相可使宽峰有所改善。30. 柱平衡慢的常见原因有哪些？柱平衡慢的常见原因是，组分在旧的或新的流动相中对柱吸附强，或者在新的流动相中浓度小甚至为 零。A流动相含有胺改良剂；B流动相含有离子对试剂；硅胶柱；流动相中有四氢咲喃。可考虑采用专用 柱用于特殊的方法，不用时将柱折下来，注满适当的溶剂或流动相，密封保管，不再作其它的分析。31. 用内标法实验时对内标

45、物的要求有哪些？A 内标物的结构或理化性质应与被分析组分相似或相近； B 内标物的保留值应稍大于或小于被分析物 的保留，不能相差过大；C内标物的峰要与所有被分析物的峰有良好的分离度（R大于1.5），不能让内标物 成了干扰物；D无结构相似的内标物，可用保留相近的内标物；E仪器对分析物的响应与内标基本一致， 出峰面积大小不能相差悬殊。32. 管子切割与安装注意事项？A管子的断面必须垂直，否则，将会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。B确保管子内表面不被损伤， 如果损伤，可能会发生管路堵塞。C将管子完全插入开口端，直至其与开口端的末端相碰为止。否则，将 会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。D不要过分拧紧螺

46、帽，以防损坏螺纹。33. 什么是HPLC的无限直径效应？在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高压流动相，样品以柱塞式注入色谱柱后，因柱的阻力 大，样品分子在柱中的分子扩散很小，直至它从色谱柱流出也未与色谱柱内壁接触，因而引起的色谱峰形 扩展很小，能保持高柱效。34. 如何评价一台检测器？A 噪声：通常噪声是指由仪器的电气元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高 频噪声和基线的无规则波动；B 基线飘移：漂移是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间（ 0.51h ）内观察到。它可掩蔽 噪声和小峰。漂移与整个液相色谱系统有关，而不仅是由检测器引起的；C 灵敏度（最小检出浓

47、度或最小检出量）：在一个特定分离工作中， 检测器是否有足够的灵敏度是十分 重要的。当比较检测器时，常使用敏感度这一性能指标。敏感度即指信号与噪声的比值（信噪比）等于2 时， 在单位时间内进入检测器的溶质的浓度或质量；D 线性范围：在进行定量分析时，希望检测器有宽的线性范围，以便在一次分析中可同时对主要组分 和痕量组分同时进行检测；E 检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的 1/10 ，否则会产生严重的柱外谱 带扩展。35. 如何简单判断比例阀是否内漏？设定泵使用一个单独通路（A）,打开Purge阀，流速5ml/min，提起其他溶剂瓶内的溶剂过滤头直至离 开液面，观察这些通路

48、（B、C、D）内的溶剂是否随着流动，正常时均不应流动。清洗预柱：先用异丙醇超声，再用高纯水超声清洗，然后用甲醇超声，效果还可以，但不知 道能坚持多久；最好的办法是更换，而且价格也不贵保护柱与预柱的区别？答：严格来说，这两种东西是不同的。保护柱叫Guard Column,是装在分析柱前，进样器 后，其填料性质应与分析柱相同或相近，只是颗粒直径大一些，主要是保护分析柱不被样品 中的强保留杂质或颗粒物污染。可能的影响是在流路中多些接头，导致系统的死体积加大， 不过一般影响不大。如果柱效下降的很明显，而且柱压上升，就应该更换保护柱，最好用卡 套式的，可以换柱芯，成本低。打开看看，脏了就需更换。预柱叫P

49、re-Column,应该装在泵后，进样器前，起到饱和流动相和过滤杂质的作用（过 去的硅胶填料对流动相要求较高，超出2-8的pH范围后填料会溶于流动相中，预柱就是牺 牲其中的填料来饱和流动相，以保护分析柱）。预柱可自装，一般是先购买已经填装好但可 开卸重填的预柱（不同于方便的卡套+ 柱芯的模式），然后要备好散装填料（购买1-3 克就 足够一段时间了）。散装填料的要求不高，一般用较粗的粒径如10 m的硅胶就可以。重装 时倒出原填料，用甲醇拌好新填料填入即可。如果分析用流动相的pH在2-8的范围内，就 不必一定要用预柱。预柱和保护柱的不同点：1安装位置不同:一般预柱安装在进样阀之前，而保护柱安装在色

50、谱柱之前.2作用不同:预柱对流动相起作用，而保护柱对进的试样起作用.3因为以上两点不同,故对系统产生的效果不同和对各自的要求也是不同的.在实际工作中，我们经常能遇到基线的漂移的情况。关于基线漂移（或上下波动） 的原因，可能有以下几种：1：柱子的平衡时间长。一般来说，新柱子的平衡时间要短。有些老柱子的平衡 是时间长。当然，柱子的平衡是时间也和它使用的流动相有关系。如果使用了离 子对试剂，那么比普通的简单的流动相（例如 二元流动相：甲醇：水，乙腈： 水） 2：系统存在漏点。如果系统存在漏点，那么出现基线向下漂移。需要检漏 RD3： PUMP头有气泡。PUMP头的气泡会导致基线的漂移和波动。如果怀疑

51、是PUPM头有气泡导致基线不稳，只需要看仪器的压力是否稳定就好。4：流动相脱气。如果流动相没有脱气，基线肯定是不稳的5：柱后气泡。在柱子后有气泡产生，导致检测器中的读数有波动6； PUMP密封不好。密封不好，也会导致PUMP头的气泡（好象不可能）和漏液, 基线当然不稳定了.7：系统的环境。仪器的使用，如温度的变化，流速的变化以及梯度洗脱，当然 基线漂移8：单向阀堵塞或污染。单向阀的睹塞和污染，能造成流量不准确，压力 波动。 故也会波动，漂移9：检测器污染或有杂质二：基线不平原因很多，可根据谱图的表现分析： 一直上扬或下降型：柱环境平衡慢， pH 不对，流动相酸挥发等，有时和梯度洗 脱也相关；小

52、幅缓慢波动（5-10min）:温度不稳；较大幅的波动：考虑流动相不均匀；很高很宽的峰：流通池有气泡或被污染； 无规则上下波动：如果是旧柱子，考虑柱子污染，不容易冲平。检查出发点不外乎几点：柱子，流动相，柱温，检测器。可通过更换条件检查哪里出了问题，看你说的像是流动相的问题，你看看不用TBA,用同样洗脱强度的乙睛-水行不行。主要包括基线漂移和保留时间漂移。1、基线漂移，一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶 液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm ）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移， 则你要考虑下面的原因：1.1、柱温波动。解决

53、方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。1.2、流通池被污染或有气体。解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要， 可以用 1N 的硝酸（不要用盐酸）。1.3、紫外灯能量不足。解决方法：更换新的紫外灯1.4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及 HPLC 级的溶剂。1.5、样品中有强保留的物质（高K直）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。解决方法： 使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。1.6、检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法：将波长调

54、整至最大吸收波长处1.7、流动相的PH值没有调节好。解决方法：加适量的酸或碱调至最佳PH值2、保留时间漂移，保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要 超过15s,超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考虑以下原因：2.1、温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。2.2、流动相比例变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障2.3、色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱2.4、流速变化。解决方法：重新设定流速2.5、泵中有气泡。解决方法：从泵中除去气泡水冲柱子时一直有气泡1、提高流速2、气泡源源不断，说明虑头脏了，需清洗虑头3、甲醇水或乙腈水-水甲醇或乙腈，交替的大流量冲