高效液相色谱基线的各种问题讲解

《高效液相色谱基线的各种问题讲解》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱基线的各种问题讲解（28页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、高效液相色谱基线的各种问题L、基线漂移原因解决方法1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检 测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦 气。3、流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更

2、换流通池窗。5、流动相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱 子进行冲洗。7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂8、样品中有强保留的物质（高K值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的 基线。8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。9、使用循环溶剂，但检测器未调整。9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。10、检

3、测器没有设定在最大吸收波长处。10、将波长调整至最大吸收波长处M、基线噪音（规则的）原因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。2、漏液图2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正 常的噪音。如有必要，更换泵密封。3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器5、在同一条线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。6、泵振动6、在系统中加入脉冲阻尼器N、基线噪音（不规则的）原因解决方法1、漏液图1、见第三

4、部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的 噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成2、检查流动相的组成。3、流动相各溶剂不相溶3、选择互溶的流动相4、检测器/记录仪电子元件的问题4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。5、系统内有气泡5、用强极性溶液清洗系统6、检测器内有气泡6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池8、检测器灯能量不足8、更换灯9、色谱柱填料流失或阻塞9、更换色谱柱10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常10、维修或更换混合

5、器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置0、宽峰原因解决方法1、流动相组成变化1、重新制备新的流动相2、流动相流速太低2、调节流速3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）3、见secti on 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果 必要更换密封。4、检测器设定不正确4、调整设定5、柱外效应影响a、柱子过载b、检测器对反应时间或池体积响应过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大d、记录仪响应时间太长5、a、小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1： 10或1： 100的比例稀释样品b、减少响应时间或使用更小的流通池c、使用内径为0.007-0.0

6、1的短管路d、减少响应时间6、缓冲液浓度太低6、增加浓度7、保护柱污染或失效7、更换保护柱8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。9、柱入口塌陷9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果11、柱温过低11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75C12、检测器时间常数太大12、使用较小的时间常数P、分离度降低原因解决方法1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）1、重新配置流动相2、保护柱或分析柱阻塞图2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问

7、题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存 在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。Q、所有的峰面积都太小原因解决方法1、检测器衰减设定过高1、减少衰减的设定2、检测器时间常数设定太大2、设定较小的时间常数3、进样量太少3、增大进样量4、记录仪连接不当4、使用正确的连接R、所有的峰面积都太大原因解决方法1、检测器衰减设定过低1、采取较大的衰减2、进样过多2、减少进样量3、记录仪连接不正确3、正确连接记录仪HPLC日常维护办法之四：进样阀的问题 以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。A、手动进样阀，转动不灵原因解决方法1、转子密封损坏1、更换或调整

8、转子密封2、转子太紧2、调整转子的松紧度B、手动进样阀，载样困难原因解决方法1、进样阀安装不当1、重新安装2、定量环阻塞2、清洗或更换定量环3、进样器污染3、清洗或更换进样器4、管路阻塞4、清洗或更换管路C、自动进样阀，不能转动原因解决方法1、无压力（或电源）1、提供恰当的压力（电源）2、转子太紧2、调整转子的松紧度 3、进样阀安装不当3、重新安装D、自动进样阀，其它问题原因解决方法1、阻塞1、清洗或更换阻塞部件2、机械故障2、见随机维修手册3、控制器故障3、维修或更换控制器液相色谱基线有很多的毛刺，但总体上还是水平的，问这是什么原因导致的? 悬赏分：5 -解决时间：2006-7-20 21:

9、14液相色谱基线有很多的毛刺，但总体上还是水平的，问这是什么原因导致的? 问题补充：我所用的是液相色谱，配紫外检测器，色谱柱是新的，仪器也没有振动。毛刺是因信号频率的波动而引起，是比色谱峰的有效值频率更高的基线扰动。毛刺的存在并 不影响色谱峰的分辨，但对检测限有一定影响。规则的毛刺还算是正常你把基线放宽，就相 当于灵敏度变高。先给仪器充分的稳定时间再看看。如果真的是色谱系统出了问题，一般是这几个方面的（不管是气相还是液相都有用）:1. 氢气，空气，载气纯度不高会影响。2玻璃衬管是否脏3色谱柱是否脏，处理一下或换一个新的试一试4. 检测器清洗一下，可能有未燃烧完的杂质5. 是否漏气6进样口是否该

10、换一个垫子7.仪器是否产生较大振动8信号接收器是否已怀或者接触不良甚至还有过因为工作站出问题导致的毛刺小弟初次使用液相色谱，基线波动非常厉害怎么回事小弟科室一台电化学液相色谱闲置两年没人用过，今天小弟初次使用时调节流速为0.5mLmin工作电压设为+ 700 mV，滤波0。1 Hz，增益5nA发现基线抖得很厉害，很有规律，就是每当泵“笃”一声时就出现一个波峰，大概0.8nA 高，也不出现基线向上向下漂移，很影响测量，请问是怎么回事，谢谢八 八 八_/ _/ _/ _可能是色谱柱进了气泡，又或者色谱柱还未被流动相跑平衡（如果是柱子进气泡的话，会出现一组很有规律的峰）其实基线的波动是难免的，只要波

11、动在允许的范围之内的话，就不会影响测量你问题说的很详细，但是你还是没说：你的柱子有没有恒温箱。首先我怀疑柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、 电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）解决方法：控制好柱子和流 动相的温度。其次，我怀疑是流动相，流动相有气泡。流动相条件变化引起的基线波动大于温度导致的波 动。解决方法：使用HPLC级的溶剂流动相在使用前进行脱气，有条件可以在线脱气。如果你的泵压也波动的话，检查系统是否漏液，如果不漏液，就基本上是确定是有气泡了。其他原因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵

12、中的空气。2、漏液图2、检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有 必要，更换泵密封。3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器5、在同一条线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部， 加以更正。6、泵振动6、在系统中加入脉冲阻尼器最近在论坛里发现很多虫友在HPLC试验中经常受到基线波动或基线漂移的困扰，下面就我 本人在实验中积累的或从别处了解到的一些经验总结如下，欢迎大家指正。1液相系统没有平衡好，柱子里的流动相一直在变化，在检测器里面的吸收就会一直变化，导致

13、基线波动的发生；梯度时如果其实比例的流动相平衡时间过短也会造成基线波动；2. 实验室环境不稳定（比如温度忽高忽低，气流不断变化等），这对于没有柱温箱或只 有单向温度变化的HPLC仪器的影响尤其明显；即使有比较好的柱温箱时，也要注意别让空 调的出风口一直对照仪器吹，那样基线也可能会波动；此外实验室有电磁干扰时，也有可能 会导致此问题的发生；3检测器的流通池被污染，造成吸收的不恒定，此时需要清洗流通池；4检测器灯能量不足时，吸收会变得不稳定，这时基线一般也不稳定，特别是在低波长 处尤为明显；5当使用低波长检测时，有时流动相会使用两相或以上的等度，这时混合器的很小的混 合比例的误差都会被放大，很有可

14、能会使基线发生波动，这时将流动相按比例混合到一个通 道里时，一般都会使情况改善很多；6. 流动相里的有机相的截止波长最好要大于检测波长20nm以上，这一点切记，比如甲 醇的截止波长是210nm,乙腈是190nm。当使用230nm以下的检测波长时，如果条件允 许，最好使用乙腈，可以避免基线波动，其余类推；7. 仪器出现问题也会造成基线波动，比如流动相过滤头堵塞、入口主动阀滤芯污染、 单向阀被污染物堵塞、泵头有气泡、比例阀出故障、系统流路漏液，比如管路裂开、peek 接头没完全连上色谱柱而导致的泄露等；8没有脱气机的仪器，当流动相未脱气或脱气未彻底时，基线也会波动；有脱气机的每 次使用前都要检查一

15、下是否正常工作；9当大家使用梯度作为组分洗脱方式的时候，有条件的最好使用超纯水，磷酸盐、三乙 胺等固体液体加入试剂也最好使用HPLC级别的，因为在梯度中随着有机相（洗脱力较强） 的不断增加，流动相系统里的杂质会在基线上反映出来，导致出现鬼峰或基线波动；10. 流动相中的有机相和缓冲液的比例一定要注意调配好，缓冲液的比例不能过大，要 不然会出现缓冲盐在柱子里析出的情况，这样不但会造成基线波动的发生，甚至会造成色谱 柱毁坏；11. 当色谱柱被污染时，也会造成基线波动，这里尤其要注意的是大家在做合成中控实 验的时候，最好不要用合成的原始反应液直接进样，因为原液里面有很多非极性或极性很小 的化合物，一

16、旦进入到反相色谱柱里和非极性的C18发生相互作用，很可能就洗脱不下来 使色谱柱变性或者慢慢的被洗脱下来，造成以后的分析出现不稳定的鬼峰或者基线波动；12. 一些比较老的液相仪对电压要求很高，电压有点起伏检测器就会反映教明显，比如 老的惠普和岛津等仪器，这时需要配一个稳压电源来解决此问题；此外仪器和电脑之间连接 的数据线出问题或老化也可能会使基线波动。当然上面说了这么多的原因，个人认为还不是很全面，有些没考虑到得地方还请大家不吝补 充，以致共同进步，谢谢！高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中， 无论是残留分析还是成分分析，HPLC也已成为不可或缺的分析

17、仪器。和其它分析仪器一样, 你若想让HPLC很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良 好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范 的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师 会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，最重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。 本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的 操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。一、脱气流动相脱气对于避免HPLC系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。 HPLC

18、系统内是不希望有气泡存在的。HPLC泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体 的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下 降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力 低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将 停止运转。当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中, 随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在 检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司 设计一个反压控制器，这样可以在

19、检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中 直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏 检测器。紫外/可见光（U V/VIS ）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过 流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例 如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去 荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的 电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还 会导致保留时间不重现。所以，必须注意消除

20、流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如 PTFE管）渗透进流动相中。如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免, 或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种：1. 吹氦脱气法。利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在O.IMPa压力下，以约60 mL/min流速通入 流动相储液容器中1015min,可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80% 的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部 气体排除。这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好， 但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法

21、。2. 加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的 比例会有变化。3. 抽真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至0.050.07MPa即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使 混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。4. 超声波脱气法。将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中，用超声波震荡1020m in。此法的脱气效果最差。5. 在线脱气法。现在商品的HPLC仪器，均可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。建议购 买仪器时一定要购买，有的公司是作为选购件，所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。二、过滤任何颗

22、粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此，要采取各种预防措施，包括 操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从 而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。在HPLC系统中，颗粒物的主要 来源有三个途径：流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。1、流动相如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级 的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2 p m微孔滤膜过滤。 同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超

23、纯水净化系统制备的水，最后一 步也是通过0.2 p m微孔滤膜。然而，如果有任何一种缓冲液中加入了固体物，例如磷酸 盐，流动相过滤将是必要的一个步骤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能 含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边缘挤压就会产生塑料颗 粒。在这种情况下，添加的一种固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒存在于流动相中 成为残渣。流动相通过0.45 p m微孔滤膜过滤对于从流动相中除去所有颗粒物是一个有效 方法。0.2p m微孔滤膜也可以用，但是它们就这个应用而言并不比0.45p m微孔滤膜更 有效，而且它的过滤速度会更慢，特别是当实验室使用的试剂和水的

24、质量不太好时。建议实 验室在编写制定他们流动相制备标准操作程序（SOPs）时规定，可以借鉴国际上同类实验 室的规定，即：流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤，反之所有流动相组成在使 用前必须过滤。在连接储液瓶和泵的输液管的末端入口采用下沉式过滤器（常见材质有熔融 玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很重要的。这个过滤器的规格为羽0 p m的微孔物 质，所以它不能取代流动相过滤步骤，但是它能除去系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使 用的可靠性。2、被测样品液相系统中的第二个颗粒物来源是被测样品。一些实验室在将他们的样品放置在自动进样器 盘（或手动进样）以前，所有样品都先通过一个0.45 p m

25、针筒式过滤器过滤。这是一个有 效除去被测样品中颗粒物的方法。但是这个过程也有一点需要关注：你使用了针筒式过滤器 就不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会有或多或少的丢失。丢失来自这样几方面： 过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏 等。如果有丢失，过滤后液体中被测物的含量或浓度与原基本样液的含量或浓度还相同吗？ 这个问题一般需要通过实验确认。确认这步是要增加工作量和费用的。过滤器的使用是一种 消耗，每个过滤器的价格从几元到十几元。但在做食品中残留物分析时，由于基质大多比较 复杂，所以过滤这步已成为不可或缺的一步。在实际分析工作中，一般检测每一组样

26、品 会带一个外标、一个添加回收或是质控样品，所以，只要最终检测时得到的信噪比能满足检 出限要求，可将这步视为系统误差而忽略。3、仪器系统部件的磨损物最后，在HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。 关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。第一种建议认为，在一般实验室中输液泵密 封垫通常使用寿命为六个月到一年，因此建议半年或一年更换这些密封垫，实验室应基于上述观点制定定期预防性维护计划。该观点认 为：与输液泵密封垫颗粒堵塞柱子而更换新柱子的费用相比，更换密封垫的费用低些。一些 输液泵有玻璃砂芯或筛网，可在流路中滤掉从泵密封垫磨损下来的颗粒物，防止这些颗粒物 随流

27、动相流至柱头。若有这种装置应查阅输液泵操作手册，查看推荐的这种过滤器清洗或更 换的间隔。另一种建议则认为，原装密封垫的密封效果最好，更换以后容易引起流动相渗漏。 所以，只要不漏液就不要轻易更换密封垫。两种说法都有其道理，具体如何操作，建议与仪 器公司工程师沟通，各公司的仪器还是有些不同的。自动进样器旋转轴的密封随着使用时间 也会磨损，但是在我的经验中，即便是高负荷的运转旋转轴密封垫也可以使用几年。如果你 的自动进样器系统有计数进样阀转动次数的功能，你可以设定一个警铃当预设阀转动次数已 达到时提醒你。曾有一种说法，进样器最多转动20,000次，这仅仅是进样10000个；但这 似乎不是实验室涉及的

28、常规样品分析使用寿命，它们的实际使用寿命会更长。旋转轴密封磨 损后会渗液，比较明显的特征是同一样品多次进样后，峰面积值差别比较大（RSD5%）。当然，输液泵的密封垫和旋转轴的密封垫磨损将 增加更多研磨物在流动相中，加速对这些部件的损伤。此外，如果你日常运行的流动相有缓 冲盐，如磷酸缓冲盐，密封垫的磨损会更快。无论颗粒物源于何物，实验时都要将其除去。 推荐在HPLC系统中采用一个0.45或0.5 Mm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子 之间，即使已使用了保护柱。这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如采用一个 玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又方便（几分钟就可更换）。若采用在线过滤，HPLC

29、系统检 测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升一定值，例如25%或增加500psi,应该更换 玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。三、冲洗使HPLC系统良好运行的第三个要点是保持系统的清洁。你需要关注流动相流经该系统的 所有地方，对于这些地方经常性的冲洗，将使你的系统保持在“Ready”状态。1、流动相储液瓶首先要经常清洗流动相储液瓶，或者每做一批新样品更换一次流动相。一个脏的储液瓶将会 污染注入的流动相。建议储液瓶中缓冲液使用时间不要超过一周，而有机溶剂使用时间不要 超过一个月。也有人建议储液瓶中保持用溶剂充满，直到更换分析方法储液瓶需更换新溶剂 （流动相组成发生变

30、化）时，将旧溶剂倒掉更换新溶剂，这样胜于将溶剂用完。但这对于分 析样品量少的实验室而言似乎有些浪费。仪器公司的工程师建议储水瓶的水要天天换，每周 瓶子还应该用异丙醇清洗一次。有的实验室则在水里加入0.11 mM的甲酸抑制微生物的 生长。这些做法看起来有些繁琐，但却能起到“磨刀不误砍柴工”作用。2、泵接下来要冲洗的是泵。千万不要一分析完冲几分钟后就停泵，特别是当流动相中含有难挥发 的缓冲液（如磷酸盐）时。如果仪器不是连续使用，当流动相蒸发时，难挥发物就会粘在活 塞密封垫的表面，难挥发物将形成固形物沉淀。这是泵密封垫磨损和单向阀渗漏的主要原因 之一。所以，无论使用长短，在停泵以前一定要用非缓冲液流

31、动相冲洗泵在半个小时以上， 要是流动相中有难挥发缓冲盐则建议冲洗的时间应该更长些。3、自动进样器自动进样器也要按规定清洗。现在的仪器多配有自动进样器的冲洗液瓶，通常只要注意及时 更换、补充冲洗液即可。自动进样器用的洗涤液也要采用与流动相相同的方式处理，并根据 溶剂的有效期和规定，清洗储液瓶或更换洗涤液。现在的自动进样器设置、操作都很简单， 如果时间允许（特别是利用夜间运行），每次分析完后设置进1、2针纯溶剂（如甲醇、乙 腈），也是一个好做法。4、色谱柱对柱子的污染是随使用时间而增加。通常表现是：运行走基线时在记录的色谱图中基线噪音 增加，泵压也增加。解决这个问题的最有效方法就是在每一批样品分析

32、结束后或准备卸下柱 子时用大量的流动相冲洗柱子（例如，甲醇、乙腈和水）。用梯度冲洗效果更好，具体的比 例要根据柱子的说明书和性质而定。5、检测器如果是正常使用，检测器将依据其性质并按照说明书规定进行洗。例如UV/VIS检测器或 FL检测器，在对柱子和系统进行冲洗时也就一同对检测器流通池中污染物进行了清洗。但 是蒸发光检测器或质谱仪则需要按照说明书进行定期清洗。这些检测器在使用时会有难挥发 污染物沉积，如质谱仪离子源的喷针、毛细管、锥孔板、预四极等部件，因而需要定期清洗。 而且对联有这些检测器的系统冲洗时，最好与这些检测器断开，以减少对检测器的污染。总 之，实验室日常使用的液相色谱仪要是能认真做

33、好这三项工作一一脱气、过滤和冲洗，你的 仪器可以得到良好的预防性维护，使用时就会感到比较顺手。当然，在实际操作时遇到的问题并没有这么简单，但这三个良好习惯将是正确操作、使用HPLC系统的基础。 感谢各位的关注，好的资料大家一起分享 如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级 的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2 p m微孔滤膜过滤。 同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一 步也是通过0.2 p m微孔滤膜。我感觉还是要过滤的，进口的甲醇，乙腈真的可以不要过滤了，国产的就得过滤啊，里面蚂

34、蚁都有哦OOOO液相色谱常见问题及处理方法HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法1、样品量不足，解决办法为增加样品量2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器4、检测器衰减太多。调整衰减即可。5、检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数6、检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。7、检测池中有气泡。解决办法为排气。8、记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。9、流动相流量不合适。调整流速即可。10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 为什么HPLC柱柱压过高柱压过高是HPLC柱用户最

35、常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问 题，您可按下面步骤检查问题的起因。1、拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再 检查；3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接 检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将 筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之 间接一个在线过滤器便可避免柱压过高

36、的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是 解决这一问题的最佳选择。液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化漂移现象1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象1、流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3、流动相

37、不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合HPLC仪器问题1、我的HPLC泵压明显的偏高，请问可能的原因？答：流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞； 流动相粘度过大；柱温过低；缓冲盐结晶；压力传感器故障。2、基线不稳，上下波动或漂移的原因是什么，如何解决？答：a.流动相有溶解气体；用超声波脱气15-30分钟或用充氦气脱气b. 单向阀堵塞；取下单向阀，用超声波在纯水中超20分钟左右，去处堵塞物c. 泵密封损坏，造成压力波动；更换泵密封d. 系统存在漏液点；确定漏液位置并维修f柱后产生气泡；流通池出液口加负压调整器g检测器没有设定在最大吸收

38、波长处；将波长调整至最大吸收波长处h柱平衡慢，特别是流动相发生变化时；用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时， 在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。3、接头处为何经常漏液，如何处理？答：接头没有拧紧；拧松后再紧，手紧接头以手劲为限，不要使用工具，不锈钢接头先用手 拧紧，再用专用扳手紧1/4-1/2圈，注意接头中的管路一定要通到底，否则会留下死体积。 接头被污染或磨损；建议更换接头。接头不匹配，建议使用同一品牌的配件。4、进样阀漏液是如何造成的？答：a转子密封损坏；更换转子密封b. 定量环阻塞；清洗或更换定量环c进样口密封松动；调整松紧度d. 进样针头尺寸不合适，一般是过短；使用

39、恰当的进样针（注意针头形状）e. 废液管中产生虹吸；清空废液管谱图问题1、问：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？答：a筛板阻塞；反冲色谱柱、更换进口筛板b. 色谱柱塌陷；填充色谱柱c. 有干扰物质的存在；使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱e.流动相PH值不合适；调整PH值，对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰 f样品与填料表面的溶化点发生反应；加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂或更改色谱 柱2、问：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？答：保护柱或分析柱污染；取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞， 拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再

40、生措施。如 果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。样品溶剂不溶于流动相；改变 样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。3、问：K值增加时，拖尾更严重，这是为什么？答：反相模式，二级保留效应；a.加入三乙胺（或碱性样品）b.加入乙酸（或酸性样品）c加入盐或缓冲剂（或离子化样品）d. 更换一支柱子4、问：保留时间的波动有几种可能的原因？答：温控不当；调节好柱温。流动相组分变化；防止流动相蒸发、反应等，做梯度时尤其要 注意流动相混合的均匀。色谱柱没有平衡；在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。 液相色谱常用符号与术语表ACN 乙腈 Acet on itrileAUFS 满量程的

41、吸光度单位 Absorbanee units, full scaleAs峰不对称因子B二元流动相中的强溶剂；例如：反相HPLC的甲醇/水混合液中的甲醇BSA牛血清白蛋白（一种蛋白质）Bovine serum albuminCAF咖啡因（中性溶质）CaffeineCRF色谱响应因子Chromatographic response function；色谱图总分离度的定量指标dc色谱柱内径（cm）DMOA 二甲基辛胺 DimethyloctylamineDNB 2,4-二硝基甲酰（基）2，4-Dinitrobenzoyldp色谱柱填料的粒度（cm）DRYLAB液相资源公司（LC Resources

42、INC.）的计算机模拟软件。DRYLAB I用于等度预测， DRYLAB G用于梯度预测F流动相的流速（ml/min）FC-113 1，1，2-三氟-1, 2，2-三氯乙烷GPC 凝胶渗透色谱法 Gel-permeation chromatographyHA酸性溶质，能电离出A-Hex 己烷 HexaneHr二相邻谱带之间的谷高HVA 高香草酸 Homovanillic acidh峰高h1,h2相邻谱峰1和谱峰2的峰高IEC 离子交换色谱法 Ion-exchange chromatographyIP 离子对 Ion-pairIPC 离子对色谱法 Ion-pair chromatographyJ

43、色谱峰强度参数K所给谱峰的容量因子，k =（tR-tO）/tO=tR /tO, tR=tO（1+k）k梯度洗脱过程中，某溶质的k的平均值或有效值kw以水做流动相k的外推值k1,k2相邻谱峰1和谱峰2的容量因子L色谱柱长度（cm）Lc检测器流动池光路的长度（cm）M溶质的分子量MC 二氯甲烷 Methylene chlorideMDST混合设计统计技术Mixture-design statistical technique； 种优化流动相的软件 MeOH 甲醇 MethanolMTBE 甲基叔丁醚 Methyl-t-butyl etherMW溶质的分子量N色谱柱塔板数NAPA N-乙酰普鲁卡因胺

44、N-Acetylproca in amide （碱性溶质）NO检测器的基线噪音ODS十八烷基硅烷OctadecylsilylP色谱柱的压力降通常以巴（bar）表示，也用psi；另外，也用作柱极性参数PA普鲁卡因胺Proca in amide （碱性物质）PAH 聚芳香烃 Polyaromatic HydrocarbonPESOS优化流动相的计算机软件（美国Perkin-Elmer产品）pKa溶质酸性常数的负对数；当pH=pKa时，溶质中有一半是电离的Rk保留值范围，Rk=（最末谱峰k）/ （最初谱峰k）RRM相对分离度图（通常N=10000）Rs相邻二谱峰的分离度S当流动相中的B改变时，测量溶

45、质保留值的变化速率的参数SAL 水杨酸 Salicylic AcidSEC 尺寸排阻色谱法 Size-exclusion chromatographyS/N 信噪比 Signal to noise ratiot分离时间（min）（样品进样时t=0） tp梯度系统的滞后时间（min）TBA 四丁基铵离子 Tetrabutylammonium ionTEA 三乙胺 TriethylamineTHF 四氢咲喃 Tetrahydrofurantk在用于校正等度洗脱溶剂强度的流动相离开梯度混合器时，梯度洗脱的时间TLC 薄层色谱法 Thin-layer chromatographyTMA 四甲基铵 Te

46、tramethylammonium （盐）TMS 三甲基硅烷 TrimethylsilyltO色谱柱的死时间（min）tR溶质的保留时间（min）tG梯度时间（min）,即梯度开始至结束的时间t1,t2相邻谱峰1和谱峰2的保留时间（min）ti色谱图中第一峰的保留时间（min）tf色谱图中最末峰的保留时间（min）tg tf-titx （tf-ti）/2UV紫外光Vm色谱柱的死体积（mL）, Vm=t0FVMA 香草扁桃酸 Vanillymandelic acidwm化合物的进样量w1,w2相邻谱峰1和谱峰2于半峰高处（W1/2）的宽度（min）W1,W2相邻谱峰1和谱峰2的基线宽度（min）

47、W1/2半峰高处的谱带宽度xd,xe,xn溶剂选择参数，分别用于测定溶剂的酸度、碱度和偶极性的程度?分离因子，？=k2/k1?梯度洗脱期间流动相成分的变化?o溶剂强度参数?化合物的克分子吸收系数?流动相的粘度（Pa?s）?流动相中强溶剂的体积份数%B二元流动相中强溶剂的体积百分比（v）液相色谱法简介气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯 物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属 盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。在经典液相色谱的 基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了

48、高效液相色谱分析法（以HPLC 表示）。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效 率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩 短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流动相）流速的提高， 板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（10?m）而 高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了 得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到110mL/mi n。从而使分析一个多 组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检

49、测器以及电子 技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和 自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。高 效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液 液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。 高效液相色谱所用基本概念：保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均 与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。 因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程H=A+B/?

50、+C?。式中：纵 向扩散项（分子扩散项）B/?对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流 动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略 不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14可知，气相色谱（GC）的流动 相流速u增大时，板高H显着增大（即柱效显着降低），而液相色谱（LC）的流速增大时， 板高增大不显着（即柱效降低不显着）。这说明高效液相色谱也有很高的分离效能，此外， 气相色谱的载气权数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。而液相色谱的载液种 类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因此流动相的选择很重要，并且在选择流动相 对

51、应注意以下几点：流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定 液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩 散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。高效液相色谱 不但具有高效、高速、高灵敏度的特点，还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动 相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，从机时可提高选择性。此 外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯 样品。由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量 大（大于400）的气相色谱法

52、不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化 合物总数的7580%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、 甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无 机盐类的分离和分析。但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵 敏度等方面，目前还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。1. 分离原理凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作 用也不同而进行分离、分析的方法。凝胶色谱的分离要理

53、和其它色谱法不同，它类似于分子 筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定 大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子（图142中以黑点表示） 随流动相沿凝胶颗粒（图142中以空心圈表示）外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的 分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲 洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用，小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有 一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样，试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞 而先后流出色谱柱，从而实现分离目的。光凝胶色谱采用水溶液作流动相进，称为过滤凝胶

54、 色谱（HFC）,而用有机溶剂为流动相时，称为凝胶渗透色谱（GPC）。2. 固定相凝胶色谱的固定相凝胶，是含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经 过交联而具有立柱网状结构的多聚体。根据凝胶的交联程度和含水量的不同，分了软质、半 硬质和硬质三种。软质凝胶（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）交联度低，膨胀度大，容量大， 可压宿，不能用于高压（使用压力低于3.5kg/cm 2或更低），主要用于含水体系的常压凝胶 色谱，半硬质凝胶（如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶），容量中等，渗透性较高，压力 可用到70kg/cm 2。适用于非水溶剂流动相；硬质凝胶（如多孔硅胶、多也玻球等），膨胀 度小，

55、不可压缩，渗透性好，可耐高压，适于高流速下操作。3. 流动相在凝胶色谱中，为提高分率效率，多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常用的 流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1, 2 一二氯乙烷、氯仿、水等。高效液相色谱仪操作步骤 高效液相色谱仪操作步骤：1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2）、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3）、打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4）、进入HPLC控制界面主菜单，点击manual,进入手动菜单。5）、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的 出水口，用针

56、头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start， 冲洗时速度不要超过10 ml/mi n。6）、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要 超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on,走基线，观察基线的情况。7）、设计走样方法。点击file，选取select users and methods可以选取现有的各种走样方 法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测 器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前 的稳流，一般2-

57、5分钟；b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同 的样品而不同。8）、进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走 完后，点击postru n,可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基 线，洗掉剩余物。9）、关机时，先关计算机，再关液相色谱。10）、填写登记本，由负责人签字。注意事项：1）、流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起 气泡。2）、柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。3）、所有过柱子的液体均需严格的过滤。4）、压力不能太大，最好不要超过2000 psi。