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1、孟凡欣孟凡欣姜姜 涛涛v用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶v用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体v用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞v限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶v连接酶连接酶vDNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度，最适反应温度75，对对95高温具良好稳定性，该酶不存在高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性外切酶活性2.用途：用途：主要用于主要用于DNA的体外扩增，经的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定次循环后才进入酶的反应稳定期，一个期，一个DNA 分子因而可被扩增分子因而可被
2、扩增4106倍。倍。DNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)，它包括以下三个步，它包括以下三个步骤：骤：DNA模板变性模板变性(95)与与DNA引物退火引物退火(45)引物延伸（引物延伸（72)v是用来在生物学寄主和试管间是用来在生物学寄主和试管间传送传送克隆的序克隆的序列的列的DNA分子分子(如从细菌到试管再到植物细胞如从细菌到试管再到植物细胞)。v其共性有四点：其共性有四点：启动自发复制的能力启动自发复制的能力 含有遗传标记含有遗传标记(通常是显性的通常是显性的)供选择供选择 多个限制酶切位点以利于插入克隆的多个限制酶切位点以利于插入克隆的DNA 非必需非必
3、需DNA序列尽可能少，以克隆更大片段序列尽可能少，以克隆更大片段Plasmid-Plasmid-独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环DNADNA分子。分子。PlasmidPlasmid chromosomechromosome v 2.7Kb的双链的双链DNA质粒质粒v 一个氨苄青霉素抗性基因一个氨苄青霉素抗性基因v 一个多克隆位点一个多克隆位点大肠杆菌：大肠杆菌：用于接受质粒：用于接受质粒：DH5、TB1、JM109、JM101 用于接受用于接受-DNA：LE392、ED8654酵母菌：酵母菌：毕赤酵母毕赤酵母 啤酒酵母啤酒酵母哺乳动物细胞：哺乳动物细胞：CHOCHO转化细菌有两个基本方法。转化细菌有两个基本方法。一是化学法：即用一是化学法：即用CaCl2 处理并加以热激促进处理并加以热激促进DNA进入菌体进入菌体二是电激法：即施加短脉冲的电荷以促进二是电激法：即施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸吸收收
分子生物学实验理论讲授
