超声波提取黑木耳黑色素的工艺优化

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1、吉林工商学院毕业论文题目名称：超声波提取黑木耳黑色素的工艺优化院系：食品工程学院专业：食品质量与安全学生姓名：邱洋学号： 421212403026指导教师：周传新二O五年五月十二日超声波提取黑木耳黑色素的工艺优化【摘要】：文章所探讨的是黑木耳黑色素提取的工艺优化丶及其实验的方法，是 以木耳粉末为材料，通过单因素试验筛选出氢氧化钠浓度、超声功率、超声时间和 料液比 4 个因素，再对后 4 个单因素进行正交试验设计，采用超声波法提取黑木 耳黑色素的工艺条件。得出的结果表明，黑木耳黑色素的最佳提取工艺条件是：氢 氧化钠浓度0.5mol.L-i,超声功率350W,超声时间9min,料液比1 ：20g.

2、ml-i。 此条件下黑木耳黑色素吸光度为 0.668，比传统溶剂法提取黑色素的提取率高 26.94%。所以与常规方法相比较,超声波提取具有萃取工艺简单、提取时间短、提 起效果较好等优点。关键词：超声波法；正交试验；黑色素；提取Determination of 6 kinds of benzene substances in plasticsfood Process optimization of ultrasonic extraction of melaninfrom black fungusAbstract :Objective:Technology optimization of the

3、extraction of melanin from black fungus;Methods:With the fungus powder as material, the ultrasonic power, ultrasonic power, ultrasonic time and material liquid ratio of 4 factors were selected by single factor test, and the process conditions of 4 single factor orthogonal experiment were designed.Re

4、sults:The optimal extraction conditions of Auricularia auricula melanin: sodium hydroxide concentration of 0.5 mol.L-1, ultrasonic power 350 W, ultrasonic time 9 min, solid-liquid ratio of 1 to 20g.ml-1. under this condition of black fungus black pigment was 0.668. The extraction of melanin was 26.9

5、4 higher than the traditional solvent method.Conclusion:Compared with the conventional method, ultrasonic extraction has the advantages of simple extraction process, short extraction time and good effect.Keywords: ultrasonic method ,orthogonal test,Melanin, abstract目录前言1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 原料1.1.2

6、试剂1.1.3 仪器1.1.4 工艺流程1.1.5 单因素试验1.2 试验方法1.2.1 黑木耳原料预处理1.2.2 溶剂法提取黑色素工艺1.2.3 黑木耳黑色素的不同提取工艺的粗品得率1.3 单因素对黑色素提取的影响1.3.1 氢氧化钠溶液浓度对黑木耳提取黑色素的影响1.3.2 超声功率对黑木耳提取黑色素提取的影响1.3.3 超声时间对黑木耳提取黑色素的影响1.3.4 料液比对黑木耳提取黑色素的影响1.4 黑木耳黑色素提取正交试验的设计1.4.1 黑木耳黑色素的提取纯化1.4.2 黑木耳黑色素溶解性实验的鉴定1.4.3 超声波优化实验2 结果与讨论 2.1 黑木耳黑色素的溶解性2.2 单因素

7、试验2.2.1 氢氧化钠浓度的确定2.2.2 超声时间的确定2.2.3 超声功率的确定2.2.4 料液比的确定2.3 正交试验3 结论 .、F 一 、-前言波可以分为次声波、声波、超声波三种。次声波的频率为 20Hz 以下；声波 的频率为20Hz20KHz；超声波的频率则为20KHz以上1。而我们日常的科学 研究中一般用到的是超声波，通常我们会应用超声波的固透作用即：在固液中能 够产生环流。所以我们一般用超声波用于实验丶科学的研究。超声波作为弹性波，能产生并传达强大的能量，方向感好，穿透能力强，逗 留时辰长2。用于固液提取可使细胞内外产生环流，来提升细胞壁和细胞膜两 者通透性，利于植物中有用成

8、分的转移、扩散3。使用一般的提取法须花费大 批有机试剂和时间才能全部提取4，而超声波在试剂中产生的剧烈振动、空化 效应、搅拌作用等提取自然活性成分，可有效的缩短提取时间5，具有明显上 风。伴随科技的进步，人工合成的色素普遍应用于各个范畴。可是经过对人工合 成的色素的探究，发觉其不但成本高、工艺繁复，并且对人体有很大的伤害，包 含毒性、致泻性、致突性与致癌性。自然色素可从动、植、微生物体内提炼，其 不仅无毒、安全系数高、颜色光泽自然鲜艳，并且另有一定的营养价值，乃至具 有一定的药理功能。黑色素：被称为“黑色素原生物质”，也可称作“色素母细胞”。是由吲哚 或者酚类化合物氧化聚合而形成的非均质高分子

9、化合物，一般呈黑色、褐色或者 棕色，黑色素普遍存在于人的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜及胆囊与卵巢等，它 也普遍存在于动植物与微生物当中6。自然界的黑色素通常归为三种：第一种 是真黑色素，呈棕黑色；第二种为脱黑索，呈红黄色等较浅的颜色；第三种称为 异黑素，呈黑色。它是一种结构稳定的复杂生物大分子，难溶于水、酸及有机溶 剂，可溶于碱性溶液，对其提取主要应用其溶于碱性溶液，而在酸性溶液中形成 沉淀的性质，且酸性溶液水解作用可除去与黑色素结合的蛋白质、碳水化合物及 脂类物质。黑色素的形态特征来源各异，并且形态和结构也大不相同。微生物来源的黑 色素种类繁多，其形态也各有差异，纵然是与相同菌种产生的黑色素，

10、跟着其培 养环境的差异，其构造也会有微小的差别。产生黑色素的微生物的种类主要有： 杆菌、假单胞菌、固氮菌，也有很多霉菌、细菌、放线菌能产生黑色素如黑曲霉， 它在生成包子的同时还可以排出黑色素，所产的黑色素主要有：黑色、红色、黄 色，还有极少数是绿色7。一般认为，黑色素不是微生物成长、代谢、繁殖所 必须的，即使黑色素在生物体内的生长发育过程中并不是必须的。但具有广泛的 生物学功能，如降低生物体受紫外线辐射、氧化及重金属毒害作用所带来的伤害， 提高生物体在某些恶劣环境下的生存力，并且它是目前所知的唯一能保护生物体 免受辐射伤害的天然内源生物聚合体8。一般的微生物中所产生的黑色素可分 为胞内黑色素和

11、胞外黑色素，其中主要的是胞内黑色素。胞内黑色素紧密地贴合 于细胞壁上，微生物产黑色素的过程受到辐射、光照和毒害的影响。另外，还有 一些真菌也会产生相应的黑色素。此外，某些微生物在各自的宿主上产生的黑色 素的能力还与毒力和致病力息息相关。黑木耳（Auricularia auricula）别名木耳、云耳等，真菌学分类属于担子 菌纲，木耳目，黑木耳科，黑木耳属，是我国珍贵的药食两用菌，也是我国主要 栽培的食用菌之一。中国是世界上主要的木耳生产国家，年产量占世界总量的 60%以上，其中湖南、湖北和北方的黑龙江省、吉林省地区产量最高。黑木耳营 养丰富、色泽黑褐、质地柔软，含有人体不可缺少的蛋白质、脂肪、

12、碳水化合物、 钙、铁、胡萝卜素、VB1、V B 2等，同时还含有胶原、植物碱、木耳黑色素、 发酵素、卵磷脂、多糖等活性成分9。其中多糖是重要的信息分子，参与机体 多种生命活动，大量研究表明多糖具有多种生物学功效，包括益气强身、补气血、 润肺、止血、止痛、通便等。也可增强抵抗力，延年益寿等等许多的功效10。 多糖类化合物在保健、医药和食品添加剂等各个范畴都具有很好的发展远景。近年来研究结果可以看出,黑色素具有抗氧化和防止衰老等等许多的功能 , 这将大大促进色素在保健食物中的应用。开展对黑木耳黑色素的提取及其性质研 究，无论对黑木耳的综合利用和深加工开发有着巨大的促进作用，高农副产品的 提升，还是

13、对黑色素的深入研究都具有十分重要的价值和社会意义。本实验将对 黑木耳提取黑色素的分析及工艺优化作进一步研究。1、材料与方法1.1 试验材料1.1.1 原料菌床木耳（新科241）子实体。放置于50C烘箱内烘干，研磨粉碎，选筛选孔径 为0屮、150屮、250屮的样品，备用。1.1.2 试剂氢氧化钠（NaOH）分析纯金锦乐化学有限公司盐酸（ HCL）分析纯广州苏诺化工有限公司三氯甲烷分析纯武汉市昕鑫化工有限公司乙酸乙酯分析纯郑州冠辉化工有限公司95%乙醇分析纯广州苏诺化工有限公司甲醇分析纯广州苏诺化工有限公司DPPH 分析纯广州苏诺化工有限公司1.1.3 仪器 高速多功能粉碎机 高速离心机 电热恒温

14、鼓风干燥箱 电热恒温水槽 电子天平TD 一 250A 一 2 型H1650 型DHG 一 9240A 型 DK 一 SD 型AL 一 104 型新世纪紫外可见分光光度计 6T 型数显恒温水浴锅真空干燥器RH 计1.1.4 工艺流程HH 一 2 型DZF 一 6050 型 DELTA-320 型取黑木耳1.000 gf粉碎一研磨一加入适量山东宇冠机械有限公司 奥豪斯仪器有限公司 上海分析仪器总厂 沈阳龙腾电子有限公司 上海亚荣生化仪器 上海安亭科学仪器厂 上海天平仪器总厂 尤尼克仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司l.Omol.L-iNaOH 溶液 超声破壁处理 一 离心 一取 1 mL 上清液

15、用蒸馏水稀释180倍 一 测其吸光度1.1.5 单因素试验按照不同提取黑色素的工艺所获得的黑色素粗品的得率结果，进行单因素 试验。计算提取黑色素粗品的得率，然后绘制得率 D 的变化曲线图。黑木耳黑色素得率(D)/%=黑色素粗品质量(g)/黑木耳干粉质量(g) X100%1.2 试验方法1.2.1 黑木耳原料预处理取黑木耳原料，干制，用粉碎机进行充分的碾磨，然后将研磨后的黑木耳粉 末通过 40 目筛，并且收集黑木耳粉末置于密封容器内，于干燥处保留。1.2.2 溶剂法提取黑色素工艺黑木耳经研磨粉碎后，筛过40目筛后，准确称取样品1.000 g,加人20 mL浓度为3 mol.L-i的盐酸，在70

16、C恒温水浴中浸提1h,离心，取沉淀用氢 氧化钠NaoH碱化至PH值为11,离心。取1mL上清液，用蒸馏水稀释180倍, 最后，在紫外-可见光光度计上测量其吸光度。通过 3 组平行试验，最后在 209 nm 波长处测得吸光度分别为 0.615， 0.619， 0.625。 最终确定吸光度值为 0.620。1.2.3 黑木耳黑色素的不同提取工艺的粗品得率通过我们对黑木耳提取黑色素不同的工艺进行比较，得到 5 种不同的提取工 艺，结果见图 1，采用超声波辅助的提取方法较其他方法所得的粗品黑色素得率 更高(6.332%)，为相对最佳的提取方法。因此本实验采用超声波辅助提取作为黑木耳黑色素提取方法。图

17、1 黑木耳黑色素在不同提取工艺条件的得率Fig. 1 The yield of black fungus black pigment in different extraction conditions1.3 单因素对黑色素提取的影响1.3.1 氢氧化钠溶液浓度对黑色素提取的影响用分析天平称取黑木耳粉末1.000 g,料液比1 ： 25条件下，通过改变加 入氢氧化钠溶液的浓度分别为 0.0， 0.5， 1.0， 1.5， 2. 0 mol. L-1， 考察氢氧化 钠浓度对黑色素提取的影响，将所得提取液离心，取 1mL 上清液，用蒸馏水稀 释 180 倍，在 209 nm 波长处测吸光度。1.3

18、.2 超声功率对黑色素提取的影响用分析天平称取黑木耳粉末1.000 g，置于NaOH浓度为0.5 mol.L-i，超 声时间9 min,料液比1 ： 25条件下，通过改变超声功率分别为200, 250, 300, 350, 400W,考察超声功率对黑色素提取的影响，将所得提取液离心，取1mL上 清液，用蒸馏水稀释 180 倍，在 209 nm 波长处测吸光度。1.3.3 超声时间对黑色素提取的影响用分析天平称取黑木耳粉末1.000 g,置于NaOH浓度为1.0 mol.L-i，超 声时间10 min,超声功率250 W,料液比1 ： 30条件下，通过改变超声时间分 别为 3, 6, 9, 12

19、, 15 min, 考察超声时间对黑色素提取的影响,将所得提取 液离心,取 1mL 上清液,用蒸馏水稀释 180 倍,在 209nm 波长处测吸光度。1.3.4 料液比对黑色素提取的影响用分析天平称取黑木耳粉末1.000 g,置于NaOH浓度为0.5mol.L-1，超声 功率 350W 条件下,通过改变料液比分别为 1： 15, 1： 20, 1： 25, 1： 30, 1：35 g.ml-i，考察料液比对黑色素提取的影响，将所得提取液离心，取1mL上清 液，用蒸馏水稀释 180 倍，在 209 nm 波长处测吸光度。1.4 黑木耳黑色素提取正交试验 为考查实验中提取工艺参数对提取成果的影响，

20、按照单因素试验结果选择不 同的影响因素进行正交试验并确定其最佳的提取工艺，归纳以上单因素实验结果, 选择提取时间、提取剂浓度、超声功率、料液比4个因素,设计4因素3水平的 试验方案,以粗品黑色素的得率为标准,确定黑木耳黑色素提取的最佳工艺条件。1.4.1 黑木耳黑色素的提取纯化将提取液调PH1.5,酸沉，离心（10000r/min,15min）,将沉淀用去离子水洗4 次，冷冻干燥,获得黑色素的粗品。将上述获得的木耳黑色素粗品于100C条件下 用Imol.L-iHCI溶液水解,2h,过滤分离，再分别用有机溶剂（三氯甲烷、乙酸乙酯、 95%乙醇）反复处理沉淀，每次得到的沉淀都用HCI调pH2.5,

21、并用蒸馏水洗涤，即 可得到精制的黑色素沉淀。1.4.2 黑木耳黑色素溶解性实验的鉴定分别称取0.0150g纯化的黑木耳黑色素置于试管中，在室温条件下（25C）分 别加入蒸馏水、lmol/L氢氧化钠溶液、lmol/L盐酸、无水乙醇、75%乙醇、正 丙醇、正丁醇、柠檬酸、氯仿各10mL搅拌混匀，静置30min，观察其在溶液中 的溶解性和溶液的颜色。1.4.3 超声波优化实验单因素试验中首先确定出最佳氢氧化钠溶液浓度， 在此基础上根据超声波分 析方法试验设计原理，设计4 因素 3 水平的正交试验方法，优化超声波提取的 工艺参数。试验因素与水平设计见表 1。表 1 黑木耳黑色素提取实验因素和水平Tab

22、le 1 Experimental factors and levels of Melanin Extraction from black fungus超声功率 （X ）/W1超声时间 (X )/min2料液比(X )/g.mol-1氢氧化钠浓度（X ）/mol.L-14-130061:150.5035091:2011400121:251.52、结果与讨论2.1 黑木耳黑色素的溶解性如表 2 所示，黑木耳黑色素在不同的溶剂中溶解度不同。这表明黑木耳黑色素与酪氨酸合成黑色素不溶于水、酸溶液、盐溶液和正丙醇、正丁醇、氯仿等 有机溶剂中，这与黑色素的溶解性质相符。黑木耳黑色素与酪氨酸合成黑色素溶 解

23、性质相同，在溶解液中颜色略微有不同，黑木耳黑色素溶液为棕黑，而酪氨酸 合成黑色素为黑色。表 2 酪氨酸合成黑色素和黑木耳纯化黑色素溶解性Table 2 Solubility of synthetic tyrosine melanin and purifiedAuricularia auricula melanin溶解实验溶剂合成黑色素黑木耳黑色素蒸馏水-水无水乙醇+淡黑色+棕色75 C乙醇+淡黑色+棕色正丙醇-有机溶剂正丁醇-氯仿-1mol/L 盐酸溶液-酸3mol/L 盐酸溶液-1mol/L 氢氧化钠溶液+棕黑色+棕黑色碱pH8 柠檬酸氢二钠缓冲 液+黑色+棕黑色盐rm1mol/L 氯化钠溶

24、液2.2 单因素试验2.2.1 氢氧化钠溶液浓度的确定按照超声波辅助提取工艺，分别用浓度为lmol/L氢氧化钠溶液、lmol/L盐 酸、95%乙醇溶液和水按料液比l:30(g.ml-1进行提取。表 3 溶剂对黑木耳黑色素提取率的影响Table 3 Effect of solvent on the extraction rate of melanin from black fungus溶剂项目 氢氧化钠溶液 盐酸溶液乙醇溶液水得率/%6.3320.3862.5631.217从表 3 可知，用 1mol/L 氢氧化钠溶液作为提取溶剂的效果好于其他溶剂的 提取效果，说明黑色素是碱溶的，碱溶液对黑色素

25、选择性高，溶解力强，提取率 高。95% 乙醇溶液也有一定的提取效果，可能是由于粗品黑色素上结合的蛋白、 碳水化合物以及脂类物质而造成的一定的醇溶。而黑色素不溶于 1mol/L 盐酸溶 液。NaOH 浓度对黑色素提取的影响结果如图 2 所示。NaOH浓度/mol.L-1o.o0.511.52吸光度A0.130.440.150.090.04由图2可知，提取溶剂氢氧化钠溶液浓度在0.000.50 mol.L-i时，随 着氢氧化钠溶液浓度的上升，木耳黑色素的吸光度逐步增加，当浓度超过 0.50 mol.L-1 时， 一些碱溶性杂质的溶出量随之增加，这些杂质成分与黑木耳黑色素 竞争溶出，导致木耳黑色素溶

26、解度降低，吸光度有所下降。2.2.2 超声时间的确定 超声时间对黑色素吸光度的影响，结果如图 3 所示超声时间/min3691215吸光度A0.020.590.750.640.6图 3 超声时间对黑色素吸光度的影响Fig.3Effect of ultrasonic time on the absorbance of melanin由图 3 可知，超声作用 9 min 时，吸光度较大。 随着时间的延长，吸光 度开始有所下降。这可能是超声波引起的机械剪切作用导致提取到溶液中的黑色 素结构变化而损失。超声波在短时间内可以充分提取黑木耳黑色素，从而体现了 超声波辅助提取省时的优点。2.2.3 超声功率

27、的确定 超声功率对黑色素吸光度的影响，结果如图 4 所示超声功率/w200250300350400吸光度A0.660.670.730.850.831300淇07超声功率/W350图 4 超声功率对黑色素吸光度的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the absorbance of melanin由图 4 可知，超声功率在 350W 时吸光度较大。 由于提取包括扩散、渗 透、溶解等过程，提取功率愈大，提取愈完全；当扩散达到平衡时，增大超声功 率，提取率不再增大。2.2.4 料液比的确定 料液比对黑色素吸光度的影响，结果如图 5 所示料液比/g.mlT1:1

28、51:201:251:301:35吸光度A0.540.630.50.370.28111:141:201:55鰹0.55料液比/g.ml-1图 5 料液比对黑色素吸光度的影响Fig.5 Effect of material liquid ratio on the absorbance of black pigment由图5可知，当料液比大于1 ： 20时，增大料液吸光度也随之升高；小于 1 : 20，吸光度随料液比的增加而减小；料液比在1 ： 20时，溶剂对于黑色素的 溶解趋于饱和。 大于 1： 20，溶剂用量少，木耳细胞组织不能完全被湿润；小 于 1： 20，溶剂用量多，在一定的超声功率下多出

29、部分溶液蒸发不但消耗了超声 能量，而且使渗透到细胞内的溶液汽化不充分。2.3 正交试验综合以上单因素试验结果，选择超声波提取时间、超声波功率、提取剂浓度、 料液比 4 个因素，设计 4 因素 3 水平的试验方案，以粗品黑色素得率和色价为 指标，确定黑木耳黑色素超声波辅助提取的最佳工艺条件 。表 4 正交试验结果Table4 Orthogonal test results试验号超声时间/min超声功率/W氢氧化钠浓度/(mol.L-1)料液比/(g.mol-1)粗品得率/%111116.59212224.98313334.8421237.09522315.89623124.69731326.19

30、832114.09933235.39K116.3719.8715.3716.57K217.6714.9617.4615.86K315.6714.8816.8817.28R24.992.091.42由表4可知，根据极差R值的大小，进行因素影响的主次排序:超声功率氢氧 化钠浓度超声时间料液比,说明超声功率对黑色素得率影响最大。四种因素最 佳组合为:提取时间60min,温度30C,氢氧化钠浓度为1.0mol.L-1料液比为 1:50。在此条件下提取木耳黑色素，三次实验的平均值为7.16士0.37%。3 结论实验结果表明，超声波辅助法对黑木耳黑色素进行提取实验，初步鉴定了黑 木耳黑色素是DOPA途径合

31、成的色素，同样我们也得出了各种工艺提纯的最佳条 件，使我们在在黑木耳黑色素的提取工艺上进行了优化，得出超声波辅助提取工 艺与常规方法相比较具有提取工艺简单、提取时间短、提取效果较好等优点，可 以有效提高生产效率，并且对以后的生产生活有着巨大的帮助，并且在单因素试 验的基础上，通过正交试验极差分析，得到了黑木耳黑色素超声辅助提取的最佳 工艺条件，工艺条件为提取时间60min,温度30C,氢氧化钠浓度为l.Omol.L- 料液比为 1:50。这个结论不仅仅是我们实验的结束，同样为黑木耳提取黑色素 进一步深入研究提供一定参考。参 考 文 献 ：1 梁平,超声波化学沉积的研究现状.2010 年 3 期

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37、秦巴山区黑木耳黑色素的提取及抗氧化能力研究J.食品工业科技，2014，35（13）： 87.致谢在此论文完成之际，我要衷心的感谢我的指导教师老师。从毕业论文题目的选择， 到实验研究，再到本论文的编写、修改，每一步都有侯老师的细心指导和认真的解析。 老师以丰富的经验、深厚的专业知识，使我掌握了更好的实验技能。老师得严谨求实、 意思不苟的治学态度和勤勉的工作态度对我产生重要的影响。同时感谢所有教育过我的 专业老师，您们传授的专业知识是我不断成长的源泉也是完成本论文的基础。大学四年的学习时光匆匆而过，心里多了很多的不舍与眷恋，马上就要离开我的母 校，我想念我的学校、老师、同学、朋友。这篇论文就是我大

38、学四年的终章。本篇论文是在周传心老师的悉心指导下完成的，是我们刻苦与努力的结晶。编写论 文的过程中，周老师渊博的学术知识丶严谨的治学态度丶严于律己的崇高风范丶精益求 精的工作作风丶平易近人的人格魅力深深地打动了我，在她的身上，我学习良多，感受 良多。本论文从选题丶制作丶实验再到最后完成，每一步都离不开周老师的身影。在此， 我表示深深地感谢。在编写论文的过程中，不仅仅要感谢周老师，论文里少不了教导我的诸位老师的身 影，也少不了我的同学丶朋友们，是他们夜以继日的帮助我一步步地走下去，一步步地 做实验，得出结论。同样，我的论文中不仅有我自己的观点和见解，还有很多的前人为 我们留下的智慧的结晶。在编写论文和分析实验的过程中，我也深深地认识到了自己的 不足，自己要学习的东西还有很多。学海无涯，学习知识是永无止境的。通过这次毕业论文，不仅提高了我的独立思考问题的能力而且培养了认真严谨的态 度。感谢老师在这次毕业论文中给予的指导，在实验阶段给予的建议与帮助，在此，谨 向侯导师表示我在编写论文期间给予的精心指导和关心表示最诚挚的感谢。最后，再次表示对我无助关爱的老师丶同学们的感谢，谢谢你们！