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1、大黄鱼大黄鱼Rac基因基因cDNA全全长克隆及分析长克隆及分析 主要内容主要内容v研究背景与意义研究背景与意义v技术路线技术路线v结果与分析结果与分析v结论结论v致谢语致谢语研究背景与意义研究背景与意义v大黄鱼属于硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄鱼属大黄鱼属于硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄鱼属,又名黄又名黄花鱼、黄瓜鱼、大黄花鱼，是我国特有的经济鱼种，花鱼、黄瓜鱼、大黄花鱼，是我国特有的经济鱼种，也是福建省的主要养殖种类。也是福建省的主要养殖种类。随着养殖规模扩大、世代增加，病害问题越来越趋随着养殖规模扩大、世代增加，病害问题越来越趋严重，给养殖业造成了巨大的经济损失，阻碍了大严重，给养殖业造成了巨大的经济
2、损失，阻碍了大黄鱼养殖业的持续发展。因此，从其自身的抗病力黄鱼养殖业的持续发展。因此，从其自身的抗病力入手，提高鱼体自身的免疫力来抵抗病原微生物的入手，提高鱼体自身的免疫力来抵抗病原微生物的侵袭是一个很好的途径。侵袭是一个很好的途径。1、Rac蛋白是小分子蛋白是小分子GTP结合蛋白结合蛋白Ras超超家族中最大的亚家族。家族中最大的亚家族。2、Rac在囊泡运输中发挥着调节作用。在囊泡运输中发挥着调节作用。3、近来发现、近来发现,Rac与细胞的吞噬作用有关，与细胞的吞噬作用有关，是一种免疫相关因子，是一种免疫相关因子，本实验期望克隆大本实验期望克隆大黄鱼黄鱼Rac基因序列，为以后进一步研究与基因序
3、列，为以后进一步研究与分析奠定基础。分析奠定基础。技术路线技术路线拼接拼接cDNAcDNA全长全长分析分析提取肌肉组织总提取肌肉组织总RNARNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA保守区扩增保守区扩增3RACE3RACE扩增扩增5RACE5RACE扩增扩增分析查找序列分析查找序列设计引物设计引物结果及分析结果及分析1 1、肌肉总、肌肉总RNARNA的提取结果的提取结果 图图1 1.5%1 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测大黄鱼肌肉总琼脂糖凝胶电泳检测大黄鱼肌肉总RNARNARNARNA条带清晰，表明条带清晰，表明RNARNA无明显降解，无明显降解，可用于逆转录可用于逆转录cDNAcDNA。在在200-
4、300bp200-300bp之间有之间有一条明显条带而阴性一条明显条带而阴性对照未扩增出条带，对照未扩增出条带，证明反转录反应成功，证明反转录反应成功，cDNAcDNA模板可用。模板可用。2、cDNA模板检测结果模板检测结果图图2 2 通过扩增通过扩增-actin-actin基因检测基因检测cDNAcDNA M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：特异性扩增；：特异性扩增；2 2：以水做模板的：以水做模板的阴性阴性对照对照M 1 2图图3 3 凝胶电泳检测保守区扩增产物凝胶电泳检测保守区扩增产物 M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：以水作为模板的：以水作
5、为模板的阴性阴性对照；对照；2 2：特异性扩增：特异性扩增可看到一条约可看到一条约530bp530bp的的条带，条带较清晰，条带，条带较清晰，而阴性对照无条带。而阴性对照无条带。表明扩增得到的条带表明扩增得到的条带可能就是所需条带，可能就是所需条带，将琼脂糖块回收做后将琼脂糖块回收做后续实验。续实验。3 3、保守区扩增结果、保守区扩增结果 M 1 2 产物回收产物回收 产物与载产物与载体的连接体的连接 转化转化 初筛重组初筛重组子子 图图4 4 凝胶电泳检测菌落凝胶电泳检测菌落PCRPCR产物产物 M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性
6、对照；对照；2:2:以以PCRPCR产物为模板的产物为模板的阳性阳性对照；对照；3-63-6：菌落：菌落PCRPCR4 4、PCRPCR筛选克隆子结果筛选克隆子结果M 1 2 3 4 5 6 随机挑随机挑4 4个克隆个克隆子均含有约子均含有约530bp530bp的目的条的目的条带，都为阳性带，都为阳性克隆克隆 5、3RACE第一轮第一轮PCR结果结果 图图6 6 凝胶电泳检测凝胶电泳检测3 3RACERACE第一轮反应产物第一轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：第一轮反应产物；：第一轮反应产物；第一轮扩增得到一条第一轮扩增得到一条较亮的较亮的1100bp110
7、0bp左右的左右的条带，阴性对照无条条带，阴性对照无条带带.6、3RACE第二轮第二轮PCR 图图7 7 凝胶电泳检测凝胶电泳检测3 3RACERACE第二轮反应产物第二轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：第二轮产物：第二轮产物第二轮扩增得到一条大小第二轮扩增得到一条大小介于介于250-500bp250-500bp之间的条带，之间的条带，与目的条带预期大小基本与目的条带预期大小基本相符，阴性对照无条带，相符，阴性对照无条带，表明该片段可能就是所需表明该片段可能就是所需片段，将琼脂糖块回收做片段，将琼脂糖块回收做后续实验后续实验。7、3RACE克隆产物的鉴定结果
8、克隆产物的鉴定结果图图8 8 凝胶电泳检测菌落凝胶电泳检测菌落PCRPCR产物产物 M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性对照；对照；2 2：第二轮：第二轮PCRPCR产物为产物为阳性阳性对照；对照；3-43-4：菌落：菌落PCRPCR扩增产物扩增产物两个菌落均含两个菌落均含有目的条带有目的条带 8、5RACE第一轮第一轮PCR结果结果图图10 10 凝胶电泳检测凝胶电泳检测5 5RACERACE第一轮反应产物第一轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：第一轮反应产物；：第一轮反应产物；2 2：阴性阴性对照
9、对照 第一轮扩增产生第一轮扩增产生100-100-400bp400bp的拖带，但还没有的拖带，但还没有明显条带明显条带 9、5RACE第二轮第二轮PCR 结果结果图图11 11 凝胶电泳检测凝胶电泳检测5 5RACERACE第二轮反应产物第二轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker；1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性对照；对照；2 2：第二轮：第二轮PCRPCR产物产物 经第二轮扩增经第二轮扩增,在在300bp300bp左右处有特异左右处有特异性条带出现并且阴性条带出现并且阴性对照无条带性对照无条带 产物回收产物回收 产物与载产物与载体的连接体的连接 转化转化
10、初筛重组初筛重组子子 10、5RACE克隆产物的鉴定克隆产物的鉴定 图图12 12 凝胶电泳检测菌落凝胶电泳检测菌落PCRPCR产物产物 M M：DNA ladderDNA ladder；1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性对照；对照；2 2：以第二轮：以第二轮PCRPCR产物为产物为阳性阳性对照；对照；3-53-5：菌落：菌落PCRPCR扩增产物扩增产物3 3个菌落均含个菌落均含有目的条带有目的条带 图图14 Rac基因部分序列及由此推测的氨基酸序列基因部分序列及由此推测的氨基酸序列 图中阴影部分是编码区；图中阴影部分是编码区；下划线标注为终止密码下划线标注为终止密码TAA；方框中
11、是加尾信号方框中是加尾信号AATAAA获得的片段大小为获得的片段大小为1272bp，其中包含的编，其中包含的编码区码区579bp，编码，编码193个个氨基酸。氨基酸。5端非编码区长端非编码区长80bp3端非编码区长端非编码区长613bp，具有脊椎动物典型的加尾具有脊椎动物典型的加尾信号信号AATAA和和poly A尾尾巴巴 结论结论本实验根据其它动物本实验根据其它动物Rac基因序列设计简并引物，通过基因序列设计简并引物，通过RTPCR和和RACE方法扩增出大黄鱼方法扩增出大黄鱼Rac基因基因cDNA全长全长1272bp,其中编码区（其中编码区（ORF）为）为579bp,编码编码193个氨基酸。个氨基酸。致谢语致谢语感谢韩芳老师在整个毕业论文设计过程中给予的悉心指导，感谢她对我孜孜不倦的教诲！同时感谢课题组的全体老师和同学给予的鼓励和无私的帮助！
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