分枝杆菌分离培养药敏试验及菌种鉴定方法标准化PPT80

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1、分枝杆菌分离培养、药敏试验分枝杆菌分离培养、药敏试验 及菌种鉴定方法标准化及菌种鉴定方法标准化河南CDC结核病预防控制所赵玉玲2006年4月 耐药菌株尤其是耐多药菌株的不断扩散，正日益成为我国结核病控制的一大难题，若耐药结核菌的播散和流行得不到有效遏止，将会出现较多慢性传染源，从而导致结核病治疗、管理的难度进一步加大，对国家结核病防治规划的有效实施将构成威胁。因此，监测结核病耐药性情况可以为制定、评价和完善国家结核病防治规划（NTP）提供参考依据。我国2000年全国流调结核菌耐药状况 n初始耐药：18.6%n获得性耐药：46.5%n总耐药：27.8%我国2000年全国流调结核菌耐药状况n初始耐

2、多药率：7.6%n获得性耐多药率：17.1%n总耐多药率：10.7%6种抗结核药物的耐药率顺序n异烟肼（17.6%）n 链霉素（17.3%）n 利福平（16.6%）n 对氨基水杨酸（2.8%）n 乙胺丁醇（1.5%）n 氨硫尿（1.3%)8省（次）耐药监测耐药状况 省份 耐药率（%）新病人 复治病人 总河南（1996）35.0 66.0 40.5河南（2001）29.8 60.8 35.5 内蒙 35.7 65.3 44.8 辽宁 42.1 55.8 43.3 山东 17.6 50.0 24.5 湖北 17.5 44.5 23.3 浙江 14.8 59.3 21.9 广东 13.0 38.1

3、15.58省（次）耐药监测耐药状况省份 耐多药率（%）新病人 复治病人 总河南（1996）10.8 34.4 15.1河南（2001）7.8 36.6 12.9 内蒙 7.0 36.8 16.1 辽宁 10.4 24.2 11.7 山东 2.9 19.5 6.4 湖北 2.1 21.8 6.4 浙江 4.5 35.0 9.4 广东 2.8 17.5 4.38省（次）耐药监测耐药状况省份 利福平耐药率（%）新病人 复治病人 总河南（1996）14.6 43.5 19.7河南（2001）9.6 42.6 15.3 内蒙 9.8 51.0 21.2 辽宁 11.4 29.1 13.1 山东 3.8

4、23.2 7.9 湖北 3.8 26.9 8.8 浙江 6.5 45.0 12.6 广东 3.5 22.2 5.3分枝杆菌种类n分枝杆菌(Mycobaterium)迄今报道有100多个种。伯杰系统细菌学手册将分枝杆菌军菌种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很稀的新鲜培养物，在适宜的培养温度下，7天以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆菌，其代表菌种是结核分枝杆菌(M.tuberculosis).在上述条件下，7天以内肉眼可见单个菌落，成为快速生长分枝杆菌。分枝杆菌种类n分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝

5、杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）n结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌，此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆菌对人类无致病性。分枝杆菌种类 类别 Rubyun分群 对人致病的分枝杆菌 缓 结核分枝杆菌复合群 人型、牛型、非洲型 慢 非结核分枝杆菌群 堪萨斯、海、猿 生 非结核分枝杆菌群 瘰疠 长 非结核分枝杆菌群 鸟-胞内、蟾快速生长 非结核分枝杆菌群 偶发、龟营养与发育n结核菌是兼性需氧菌，在有氧和含有比较低氧的环境下均能

6、生存，比如骨结核，淋巴结核。n在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。n结核菌生长的适宜温度和人体相近为37。n结核菌生长所必须的元素有氧、碳、氮、氢、磷、钾、镁等。结核分枝杆菌的生长特性n生长适宜温度37，PH6.87.2，对营养要求较高专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮源。在常用的罗氏培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。n结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要1018小时，根据接种量的多少，一般1030天肉眼可见菌落生长。耐药性是结核杆菌的重要生物学特性n耐药菌不断生长繁殖，终致菌群中以耐药菌为主（敏感菌被药物淘汰），抗结核药物即失

7、效。n由基因突变而出现的极少量天然耐药菌（自然变异），通常不致引起严重后果。n药物与结核杆菌接触后，有的细菌发生诱导变异，逐渐能适应在含药环境中继续生存（继发耐药）。n耐异烟肼菌株的致病力显著减弱，耐链霉素菌株的致病力一般不降低，耐利福平菌株有不同程度降低，对利福平及异烟肼同时耐药，其致病力降低较单一耐异烟肼者更显著。实验室检验技术n涂片染色镜检n分枝杆菌分离培养n分枝杆菌药物敏感试验n分枝杆菌菌种鉴定n血清学检测n分子生物学结核病细菌学实验室布局原则n结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用。n培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分

8、开的场所，最好分别在专用的房间进行。分枝杆菌分离培养检查法的重要意义n(1)不论从结核病控制、流行病学检查或临床诊断的角度看，分枝杆菌的分离培养检查法都是结核病确诊最可靠的方法，是结核病病原学诊断的“金标准”。分枝杆菌分离培养检查法的重要意义n(2)开展进一步检测的基础，是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。n(3)随着结核病控制工作水平的提高，一些具备条件的基层结核病细菌学实验室也应逐步开展分枝杆菌的分离培养.酸性改良罗氏培养基n成分和制备方法略。去污染处理(痰标本)n视标本性状，加12倍体积4%氢氧化钠（NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋震荡器上震荡1

9、min，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在1520min。标本较多时，应分批处理n病理组织或干酪块 标本切碎后置于无菌组织研磨器，加入适量（0.51ml）生理盐水后充分研磨成混悬液；混悬液经3000r/min离心30min后，沉淀物进行碱处理与24倍量2%氢氧化钠（NaOH)混合，处理15min后接种。n尿液 留全量夜尿，静置45h,取沉淀部分约10ml,3000r/min离心30 min,取沉淀进行碱处理与等倍量4%硫酸（H2SO4）混合,处理15min后接种.去污染处理(其他标本)去污染处理(其他标本)n脓液 采用4%硫酸（H2SO4）以13混匀后，静置25

10、min（期间震荡数次)，按无菌手续接种0.1ml经处理的标本至L-J培养基，每份标本接种2支培养基。酸处理去污染时间不超过25min。n胸腹水,支气管灌洗液标本 参照痰标本处理办法.去污染处理(其他标本)n脑脊液 无菌操作收集的脑脊液,置冰箱或室温24h,待薄膜形成后将薄膜接种到L-J培养基;或将脑脊液 在无菌操作环境中3000r/min离心30 min,取沉淀直接接种到L-J培养基.非无菌操作采集的脑脊液标本,离心后的沉淀进行碱处理与等倍量4%氢氧化钠（NaOH)混合,处理1015min后接种于酸性L-J培养基去污染处理（其他标本）n粪便 标本与生理盐水混合后,充分振荡使之成为混悬液;定性滤

11、纸过滤后,滤液经3000r/min离心10 min;沉淀进行酸处理与24倍量的4%硫酸（H2SO4）混合,处理1520 min)后接种L-J培养基.n咽喉棉拭子 将棉拭子放入一无菌试管,加入适量生理盐水浸泡,加入等体积 4%氢氧化钠（NaOH)后强烈振荡,静置15 min后接种.分离培养的操作流程 痰标本中、加12倍体积4%NaOH涡旋振荡12min室温静置15min分别接种0.1ml前处理液至2支培养基斜面置37 温箱培养接种后3天,7天观察,此后每周观察一次有菌落生长需经抗酸染色确认,至第8周无菌落生长报告阴性简易培养程序简易培养程序离心培养程序离心培养程序离心力对痰涂片和培养结果的影响离

12、心力（xg）涂片阳性（+）培养阳性（+）涂片阳性/培养阳性比率12601.87.10.2530004.511.20.4038009.611.60.83结果报告n1.接种后第3、7天各观察1次菌落生长情况。发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察1次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。满8周后未见菌落生长者方可报告培养阴性结果。结果报告n2.观察时发现非结核分枝杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应控制在2%5%范围。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。结果报告n培养结果报告

13、方式n(1)分枝杆菌培养阴性:斜面无菌落生长,以“培养阴性”报告,不可以“”表示.n(2)分枝杆菌培养阳性（）：菌落生长占斜面面积的1/4n(3)分枝杆菌培养阳性（2）：菌落生长占斜面面积的1/2n(4)分枝杆菌培养阳性（3）：菌落生长占斜面面积的3/4n(5)分枝杆菌培养阳性（4）：菌落生长布满整个斜面n(6)报实际菌落数:菌落生长不足斜面面积1/4分离培养的注意事项n选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养阳性率较高。n从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟.n涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。n发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方

14、可报告阳性。分离培养的优点n敏感性较直接涂片法高，理论上10100条菌/毫升可检出阳性；n特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度，色素产生初步判断非结核分枝杆菌；n分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提供基础。分离培养的缺点n需时长，根据接种量的大小，一般28周才能得到肉眼可见菌落。n结果受标本保存运送时间，培养基成分和质量，前处理方法等影响，操作较直接涂片法复杂，需经严格培训。n需培养基凝固灭菌器，离心机，涡旋振荡器，恒温培养箱等设备。n成本是直接涂片法的78倍。分枝杆菌快速培养检查n分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养分枝杆菌仪，通过测定细菌生长代谢而间接检测分枝杆菌生长情况的方

15、法。由于应用营养丰富的液体培养基，并且检测仪能连续检测，故提高了从标本中分离分枝杆菌的敏感性进而缩短报告结果的时间。为保证检查方法的可靠性，目前快速培养检查系统除提供相应仪器，试剂以外，均根据不同系统制定了相应的临床标本前处理、接种、检测和报告结果的规程,故在进行相应的检查时，结果的可重复性和可比性均能得到认可。分枝杆菌快速培养检查n在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的去污染处理，必须严格按照系统说明书中规定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸杆菌后方可发出阳性报告。几种常见分枝杆菌快速培养仪nBectec-TB640全自动分枝杆菌

16、培养仪在营养丰富的培养液中加入放射性14C标记的棕闾酸作为底物，分枝杆菌生长过程中分解14C棕闾酸，产生CO2，仪器通过检测CO2含量换算成生长指数。培养时间通常需要425天。n优点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌种鉴定。n缺点：价格昂贵，需进口专利液体培养基，且有放射性污染，正逐渐被非放射性的培养方法所替代。几种常见分枝杆菌快速培养仪nBectec-tb960全自动快速细菌培养系统是将荧光物质包埋在7H9液体培养管的底部，分枝杆菌生长过程中，O被消耗，底物产生荧光，仪器通过测定荧光强度，用生长指数来表示测定结果，培养时间通常需要742天。n特点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌种鉴定。

17、连续测定荧光强度，每60分钟自动测一次，无放射性污染。几种常见分枝杆菌快速培养仪nBect/alert 3D全自动快速细菌培养仪，分枝杆菌生长过程中代谢产生CO2，CO2的产生使瓶底颜色感受器产生不同的颜色变化。通过比色传感器来测定，CO2产生的速率和总量与细菌生长的速率和总量一致。n简便、快速，可进行药敏试验及初步菌种鉴定。既能进行分枝杆菌培养，又能进行普通菌培养，每10分钟自动测一次，无放射性污染。药物敏感性测定的重要意义n临床治疗的重要参考n流行病学的重要指标分枝杆菌药敏试验在条件具备和有一定经验的实验室方可进行此项试验。下列情况可进行分枝杆菌药物敏感性试验：n初始结核病人观察起始耐药菌

18、感染n复发结核病人n痰菌阴转后复阳者n化疗36个月痰菌持续阳性者n痰菌减少后又持续增加者n细菌流行病学检查n非结核分枝杆菌病等药物敏感性试验常用标准方法n绝对浓度法是由G.Meissner(德国)于1964年首先提出的,是我国30 多年来一直沿用的药敏试验方法。n比例法是由法国的G.Canetti 和J.Grossete于1963 年首先提出,是WHO 全球耐药监测项目中推荐的标准药敏试验方法。二者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差别.n抗性比浊法是英国科学家D.A.Mitchison首先提出,由于方法比较烦琐,现已不多用.比例法和绝对浓度法的一致性n比例法和绝对浓度法是测定

19、分支杆菌药物敏感性的二种常规方法,前者是世界卫生组织(WHO)在“全球结核病耐药监测项目”中推荐的统一方法,后者是我国各级实验室30 多年来普遍沿用的方法。近年来,随着我国部分省陆续加入WHO 耐药监测项目,二种方法的一致性问题以及药敏试验是否向比例法转轨已成为国内争议的热点。比例法和绝对浓度法的一致性n综合以往国内有关比例法和绝对浓度法的试验报道，对2种方法研究结果显示,比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96%以上,对于结核分支杆菌,二种方法测试H、S、R 和E 的耐药率均无显著性差异。绝对浓度法向比例法转轨，将会使我们的药敏试验结果与国际接轨，与国际具有可比性，而不会影响到与我

20、国既往资料的连续性和可比性。比例法和绝对浓度法的区别n从试验技术角度讲,比例法与绝对浓度法的主要区别是:(1)绝对浓度法对接种量（10-3mg）要求十分严格,既要避免由于过量接种产生自然突变的可能,又要保证对照培养基上菌落生长旺盛,相比之下,比例法由于设定了高、低2 个（10-4mg 和10-6mg）接种量的参考系统,且试验结果的判定是通过计算活性单位的比值获得,因此对接种量这一药敏试验的重要变异因素进行了一定程度的校正比例法和绝对浓度法的区别n(2)比例法定义1%为“敏感”和“耐药”的临界点,而绝对浓度法规定低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20 个判断为耐药,按接种菌量的活菌单位计算与比例

21、法的1%耐药有相同的理论基础。在此基础上,由于绝对浓度法每种药物设定高、低2 个药物浓度,所以绝对浓度法在一定程度上反映了耐药的程度和水平。如果说比例法是定性的药敏试验,绝对浓度法则包含有“半定量试验”之意。（3）比例法操作较为繁琐，且需定量技术。药敏试验基础培养基n为无淀粉改良罗氏培养基，配方与酸性罗氏培养基相比，只有磷酸二氢钾(KH2PO4)的量不同，其他成分完全相同。抗结核药物溶液的配制和稀释n1.药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品，并确认纯度和效价，在有效期内使用。n2.异烟肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TB1)、乙硫异烟胺(TH1321)、环丝氨酸(SC)的生物效价按其重

22、量单位计算，计算用药量时只需考虑其纯度.链霉素硫酸盐（SM-SO4)、乙胺丁醇盐酸盐（EMB-Cl)、卡那霉素硫酸盐(KM-SO4)、卷曲霉素硫酸盐(CPM-SO4)、紫霉素硫酸盐(VM-SO4)、对氨基水杨酸钠盐(PAS-Na)等在考虑其纯度的同时，应按厂家标定的毫克效价计算其盐型药用量。抗结核药物溶液的配制和稀释n3.加入培养基中实际药量的计算可参考下列公式：实际药量=（培养基内药物终浓度需制备培养基体积）/（该药物纯度该药物校价1000）各变量单位：实际药量：mg 效价：%培养基内药物终浓度：g/ml 纯度：%需制备培养基体积：ml抗结核药物溶液的配制和稀释n4 绝对浓度法按所需浓度制成

23、高浓度药液，再按相应比例稀释成低浓度药液。n5.比例法按药物储存液，分装至无菌试管，每管510ml,封口，-20 保存，3个月内使用。注意事项：除RFP、TB1、TH1321用二甲基甲酰胺溶解，再用灭菌生理盐水稀释外，其他药物可用灭菌蒸馏水溶解、稀释。含药培养基制备n每100ml基础培养基加入1ml配制、稀释好的抗结核药液，混匀，无菌分装每管7ml，85 凝固50min.n制成的培养基37 无菌试验24h，检查培养基污染情况后置4 避光保存，1个月内使用。药敏试验方法n绝对浓度法和比例法药敏试验均包括菌悬液制备、稀释、接种、培养和结果报告、质量控制等。n绝对浓度法具体操作步骤略。比例法药敏试验

24、1 菌悬液制备 （1）临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无须二次传代即可做药敏试验，初生长周以后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取周的亚培养物进行试验。（2）取上述培养物（须刮取斜面各个部分的培养物）置于玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使成乳酪状，以0.Tween-80生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管（MacFaarland No.1）比浊，即配成mg/ml的菌悬液。比例法药敏试验n2.稀释n（1）菌液稀释：静置片刻，使菌液中的颗粒或菌块沉淀后，用刻度吸管或22号标准接种环将mg/ml的菌液上清逐步稀释至0.01 mg/ml和0.1 mg/ml。n(a):22号接种环100倍

25、稀释法：用22号标准接种环沾取2满环mg/ml的菌液，移至2 ml灭菌生理盐水中，即稀释成0.01 mg/ml菌液；用同样方法再进行100倍稀释，即成10-4 mg/ml菌液（注：22号标准接种环：金属丝直径0.7mm,接种环内径3mm，满环移液0.01ml）。比例法药敏试验n2.稀释 (b)微量吸管10倍稀释法：用无菌微量刻度吸管吸取0.5ml上述1mg/ml菌悬液至4.5灭菌生理盐水中，即可得到0.1mg/ml菌液.按上述方法连续进行10倍稀释，可得到10-2 mg/ml和10-4 mg/ml的菌液。比例法药敏试验n3.接种:用22号标准接种环分别沾取1环(即0.01ml)10-2 mg/

26、ml和10-4 mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种量为10-4 mg 和10-6 mg。n4.培养:接种后的培养基置于37 培养，4周后报告结果。比例法药敏试验n结果报告及解释1.按以下方式记录菌落生长情况.(1)少于50个菌落:报实际菌落数(2)50100个菌落:1+(3)100200个菌落:2+(4)大部分融合(200500个菌落):3+(5)融合(大于500个菌落):4+比例法药敏试验n结果报告及解释2.计算耐药百分比:耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上菌落数*100%若耐药百分比大于1%，则认为受试

27、菌对该抗结核药耐药。比例法药敏试验n质量控制1.若高稀释度菌液(10-4 mg/ml)在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。2.每批试验以结核分枝杆菌参考菌株(H37RV)10-3 mg检测含药培养基的质量。附：麦氏1号比浊管的制备：0.1ml 1%氯化钡(BaCl2)加入9.9 ml 1%硫酸(H2SO4)，封口，比浊前摇匀。药敏试验流程23周新鲜纯培养物磨菌，制备mg/ml的菌液稀释至适当浓度接种适当菌量至含药培养基和对照斜面37 培养4周报告结果药敏试验准备比例法结果判读举例接种量对照INHEMB 10-4+3 10-62690耐药百分数（%）34.6

28、0.1判度结果耐药（R）敏感（s）药敏试验注意事项n培养基制备：（1）药物称量、效价计算、溶解、稀释要准确；（2）用标准化的仪器和材料：培养基蒸汽凝固灭菌器，螺旋盖培养管；（3）凝固灭菌时间、温度严格掌握；（4）每次制作培养基应表明批次，使用时用H37RV敏感株作为敏感对照考核含药培养基的质量。药敏试验注意事项 试验操作：（1）应在生物安全操作台内进行操作；（2）要使用标准化的磨菌管、吸管、接种环进行稀释和接种；（3）要使用新鲜菌落，取菌落时要刮取整个斜面，不要只取单个菌落；（4）菌液制备、稀释、接种要力求准确，以保证接种量在要求范围内；（5）注意观察温箱温度。药敏试验方法局限性n在得到纯细菌

29、的培养物后仍需4周可报告结果，远远滞后于临床诊治的需要；n试验比较烦琐，结果受多种因素影响，可重复性较差；n实验室耐药与临床耐药之间有一定的差距。噬菌体法n将分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，未进入菌体内的噬菌体用特异的抗噬菌体物质灭活，进入菌体内的噬菌体得到保护而复制增殖，溶菌后释放子代噬菌体，将此噬菌体与相应的结核分枝杆菌混合，接种在固体培养基上培养，观察蚀斑的产生。蚀斑的数量与噬菌体数量有关，也与临床标本中活的结核分枝杆菌有关。n如果用噬菌体做药敏试验，若有耐药结核分枝杆菌存在，细菌能存活，会出现蚀斑，蚀斑的数量与在含抗结核药物培养基上存活的结核分枝杆菌有关。分枝杆菌菌种鉴定的意义n非结核

30、分枝杆菌的发病率在不同的国家、不同的地区报告差别很大。据资料报道，日本在1980年报告：在分枝杆菌感染中，非结核分枝杆菌的发病率为12%，并有逐年上升趋势，其中主要为鸟胞内复合群，高达89.6%，其次为堪萨斯占8.0%n我国年对非结核分枝杆菌的研究资料尚不充足，也缺乏较大规模的流调，据报告非结核分枝杆菌在我国的发病率占分枝杆菌的4.3%左右。分枝杆菌菌种鉴定的意义n一般来说，非结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性低于结核菌，但各型和各菌株之间对药物的敏感性差别甚大。分枝杆菌菌种鉴定n形态学 菌落形态、颜色n生长条件 28 生长试验，结核分枝杆菌在28 的孵育环境中不能生长；而TNM菌群的大部分分枝

31、杆菌可以生长。n生化反应 硝酸还原、烟酸试验n酶 尿素酶 耐热触酶 n分子生物学方法 分枝杆菌菌种鉴定n分枝杆菌菌群鉴定的目的既是鉴定菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌，也是进一步菌种鉴定的基础。n分枝杆菌临床分离株药物敏感性试验应与菌种初步鉴定同步进行，以对硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养基初步鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核分枝杆菌n鉴别培养基的制备过程略。分枝杆菌菌种初步鉴定 分枝杆菌PNBTCH28 生长耐热触酶硝酸还原烟酸试验牛分枝杆菌 结核分枝杆菌 +NTM +分枝杆菌菌种鉴定质量控制要求n经过初步鉴定的分枝杆菌，需进一步进行菌种鉴定，可送上一

32、级实验室。n鉴别菌株应生长旺盛，生长时间为34周为宜。n所有培养基、试剂应在规定期限内使用。n所有试剂均应用标准菌株对照试验合格后使用。分枝杆菌细菌库的建立n分枝杆菌菌株库是结核病控制、流行病学检查及开展进一步检测和研究的基础。通过对菌株库的基因分型和耐药性检测，可以发现本地区菌株流行情况，调查耐药性趋势，为结核病控制、流行病学提供细菌学方面的依据。n菌种保存决不是简单的对临床标本的单纯的存放。菌株贮存要求有严格的贮存条件，严密的贮存程序，入库菌株须专人负责，严格按照各程序进行管理，每份菌株入库、冻存、贮藏、管理各环节操作必须二人同时进行，以确保菌住质量，数据准确无误。分枝杆菌细菌库的建立n细

33、菌库程序分三部分：一、菌株贮存试验程序 包括贮存试剂（如7H9液体培基）的配制、菌株冻存管编号、冻存试验等。每批冻存菌株实验状况、冻存障碍、实验人、冻存菌株库号、冻存菌株质控管号等情况须详细记录，每批试剂配制日期、配制人等须详细，冻存菌株冻存条件等保管情况记录在册。分枝杆菌细菌库的建立二、菌株贮存质量控制程序 包括 冻存前质控 如菌株冻存管、预备冻存管、架编号、库存位置、计算机数据等一一对应，相互制约等；每批试剂配制操作须两人进行。冻存中质控 选菌龄、菌量适宜的菌株，冻存时平行接种L-J培养基，做活菌及污染试验。需增菌菌株传代二支L-J培养基，生长良好冻存，同时观察活菌及污染情况。对试验操作、

34、冻存物品、试剂质量进行监控。分枝杆菌细菌库的建立冻存后质控 冻存后应严密监视冻存温度（-45）记录停电次数及冰柜回温温度；不定期提取冻存质控菌株做细菌复活实验，观察并记录细菌生长状况及污染情况。三、菌株资料计算机数据库管理程序Gen Probe方法检测结核分枝杆菌nGEN-PROBE 用杂交保护分析方法（HPA）检测RNA扩增产物中结核分枝杆菌的特定序列。杂交试剂中含有一个单独标准的DNA探针，并有化学发光标记。这个探针可与结核分枝杆菌复合体的特定序列互补。当探针和特定序列形成了稳定的RNA：DNA杂合体后，杂交后的探针被选择，并通过GEN-PROBE LEADER化学发光检测仪检测。Gen

35、Probe方法检测结核分枝杆菌nGen Probe分子菌种鉴定包括结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌。nGen Probe结核分枝杆菌直接检测（MTD）是一种体外诊断用检测目标核酸探针的试验，可检测痰标本（流出或咳出），支气管标本（如支气管洗液或支气管吸入物）或气管吸入物标本沉积物中结核分枝杆菌的rRNA。Gen Probe方法检测结核分枝杆菌n传统的培养方法最早可以在1个星期后检测到结核杆菌，但是有可能会需要8个星期。相比较下，MTD试验可以在开始试验后2.5到3.5小时内检测出结核分枝杆菌复合体的rRNA。因此，虽然MTD试验不能探知药敏的结果，但仍然可以提供快速和可信的结核分枝杆菌的检测结果。