第六章细胞的冻复苏与运输

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1、 第六章第六章 细胞的冻存、复苏与运输细胞的冻存、复苏与运输 细胞冷冻、复苏的发展历史简介细胞冷冻、复苏的发展历史简介 17761776年，年，SpallanzaniSpallanzani最早发表了最早发表了“冷冷”处理对处理对“细胞细胞”生生命活动影响的报道。命活动影响的报道。到了到了19001900年前后，科学家基本上肯定了生物成分年前后，科学家基本上肯定了生物成分(如精子如精子)能能够在零下温度贮存的事实。够在零下温度贮存的事实。19491949年，年，PolgePolge等人发现了等人发现了甘油甘油对低温下贮存细胞的保护作用。对低温下贮存细胞的保护作用。Luyet(1951)Luyet

2、(1951)与与Lovelock(1953)Lovelock(1953)等多位学者发现等多位学者发现电解质浓度电解质浓度增大增大是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。19591959年，年，LovelockLovelock等人发现了一种新的化学保护剂，这就等人发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知的是现在人们熟知的二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)。当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术术 ，贮存时间几乎是无限的。，贮存时间几乎是无限的。一、培养物的冷冻保存与复苏原理一、培养物的冷冻保

3、存与复苏原理 冷冻保存冷冻保存(cryopreservation)(cryopreservation)：将体外培养物悬：将体外培养物悬浮在加有浮在加有冷冻保护剂冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度率降至零下某一温度(一般是低于一般是低于-70-70的超低温的超低温条件条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。，并在此温度下对其长期保存的过程。复苏复苏(thawing)(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。培养物恢复到常温的过程。无论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培无论是微生物、动物细胞、植物细

4、胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。n细胞冻存时，存在两种损伤：细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤冰晶损伤 溶质损伤溶质损伤 冰晶损伤：冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。损伤被称为细胞的冰晶损伤。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损

5、伤越大。冰晶损伤越大。溶质损伤：溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。损伤被称为溶质损伤。细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。坏，细胞便发生渗漏。n溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的

6、溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重此损伤越严重 n如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受受溶质损伤溶质损伤和和冰晶损伤冰晶损伤。保护机理：保护机理：n冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成减少冰晶的形成 ；n通过降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受通过降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。n影响冷冻效果的因素有以下几点：影响冷冻效

7、果的因素有以下几点：1.1.冷冻速率冷冻速率 不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度当冷冻速度过慢过慢时时:细胞细胞脱水脱水严重，细胞体积严严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤溶质损伤。当冷冻速度当冷冻速度过快过快时时:细胞内水分来不及外渗，会细胞

8、内水分来不及外渗，会形成较大冰晶形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内胞内冰晶损伤冰晶损伤。2.2.冷冻保存温度：冷冻保存温度：液氮温度液氮温度(-196)(-196)是目前最佳冷冻保存温度。是目前最佳冷冻保存温度。应用应用-70-70-80-80条件冷冻保存细胞，短期条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。细胞存活率明显下降。如如-70冻存冻存SNL细胞细胞(一一种小鼠成纤维细胞种小鼠成纤维细胞)，一个月内复苏，细胞存活率一个月内复苏，细胞存活率在在90%以上

9、；以上；但一个月后，细胞存活率却降至但一个月后，细胞存活率却降至50%左右；若时间再延长，细胞存活率更低甚至左右；若时间再延长，细胞存活率更低甚至为零。为零。不同细胞的最适冷冻速率不同。不同细胞的最适冷冻速率不同。例如，小鼠例如，小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为别为1.6/min1.6/min、7/min7/min和和200/min200/min。3.3.复温速率复温速率 复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是一般来说复温速度越快越好。常规的做法是:在在3

10、737水浴中，于水浴中，于1 12min2min内完成复温。内完成复温。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则！在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则！在复苏时，一般以很快的速度升温，在复苏时，一般以很快的速度升温，12min内恢内恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而无冰晶损伤暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。结构和功能。n4.4.冷冻保护剂：冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤是指可以

11、保护细胞免受冷冻损伤 的物质。的物质。n分为：渗透性：常用分为：渗透性：常用甘油、甘油、DMSO 非渗透性非渗透性 甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。n保护机制保护机制:在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，

12、从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。n甘油和甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷预冷，让，让甘油或甘油或DMSODMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，平衡以起到充分的保护作用。目前，DMSO的应的应用比甘油更为广泛。用比甘油更为广泛。n非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是非渗透

13、性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。该类保护剂主要包括些大分子物质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯聚乙烯吡咯烷酮烷酮(PVP)(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中有等。其保护机制的假设很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从由于其

14、分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。而减轻溶质损伤。n注意：注意：由于许多冷冻保护剂由于许多冷冻保护剂(如如DMSO)DMSO)在低温条件在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。n二、冷冻保存方法二、冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为冻存方法可分为非玻璃化非玻璃化和和玻璃化玻璃化冻存两种冻存两种 非玻璃化冻存非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段是利用各种温级的冰箱分阶段降温至降

15、温至-70-70-80-80，然后投入液氮进行保存；，然后投入液氮进行保存；该该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冷冻玻璃化冷冻则是指利用多种高浓度的冷冻保则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。的细胞悬液没有冰晶的形成。玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设效果，不需要复

16、杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但用，但很少应用于一般细胞的冻存。很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。琐的操作有关。n非玻璃化冻存冻存方法举例（肿瘤细胞）非玻璃化冻存冻存方法举例（肿瘤细胞）n1.1.主要材料主要材料n(1)(1)仪器设备：普通冰箱、仪器设备：普通冰箱、-30-30低温冰箱和低温冰箱和-70-70-80-80超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等

17、。n(2)(2)冻存管：容量为冻存管：容量为1ml1ml或或1.5ml1.5ml。n(3)(3)冷冻保护液：一般是以含冷冻保护液：一般是以含20%20%小牛血清的细胞小牛血清的细胞培养液与二甲基亚砜培养液与二甲基亚砜1 1份以份以9 9：1 1混合而成混合而成。现配现。现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴融解。用前，于室温下水浴融解。n(4)(4)待冻存细胞：各种肿瘤细胞待冻存细胞：各种肿瘤细胞 2.2.冻存过程冻存过程 (1)(1)待冻存细胞悬液的准备待冻存细胞悬液的准备 按常规方法消化处于按常规方法消化处于对数生长期对

18、数生长期的细胞培养物的细胞培养物,制制备成单细胞悬液备成单细胞悬液,计算细胞总数。计算细胞总数。将细胞悬液以将细胞悬液以8008001000r1000rminmin离心离心5min5min，弃上清，弃上清液。液。向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达度达1 110106 61 110107 7个个/ml/ml。按每管按每管1 11.5ml1.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。盖。在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。(2)(2)分级冷冻：分级冷冻：（有几种

19、方法可以使用）（有几种方法可以使用）先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4(4 8)8)，约，约40min40min。接着置于普通冰箱冷冻层接着置于普通冰箱冷冻层(-10(-10-20)20)，303060min60min。再于再于-30-30放置放置30min30min左右（左右（可省略可省略）。）。然后在然后在-70-70-80-80下过夜。下过夜。最后将冻存小管投入液氮保存。最后将冻存小管投入液氮保存。n还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口液氮罐口20 min20 min，再直接投入液氮中保存。，再直接投入

20、液氮中保存。n第三种方法是，用第三种方法是，用44预冷的冷冻保护液悬浮细胞，预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在分装冻存小管后，将冻存小管放在44下下30min30min；然后置于壁厚然后置于壁厚1 cm1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在立刻将小盒放置在-70-70-80-80冰箱中冰箱中24h24h以上至以上至1 1周；再将冻存小管投入液氮中保存。周；再将冻存小管投入液氮中保存。n(3)(3)记录：记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、细胞代号、冻存

21、管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。冻存位置以及冻存经手人。n3.3.冻存结果冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达如此冻存的细胞，其存活率可达90%90%以上。以上。注意事项：注意事项：n在使用在使用DMSODMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其前，不需要对其进行高压灭菌，因其 本身就有灭菌作用。本身就有灭菌作用。n在常温下，在常温下，DMSODMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护对人体有毒，故在配制冷冻保护 剂时最好带手套。剂时最好带手套。n冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免 液氮从液氮罐内溅出。液氮从液氮罐内溅出。n应注意控

22、制冻存细胞的质量。应注意控制冻存细胞的质量。n勿将冻存的细胞放置在勿将冻存的细胞放置在0 0-60-60这一温度范围内这一温度范围内 过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。三、非玻璃化冻存细胞的复苏三、非玻璃化冻存细胞的复苏 1.1.主要材料主要材料 (1)(1)仪器设备：恒温水浴箱、普通离心机。仪器设备：恒温水浴箱、普通离心机。(2)(2)培养用液：完全培养液（培养用液：完全培养液（20%20%血清血清+基础基础 培养液）培养液）2.2.复苏过程复苏过程1)1)将恒温水浴箱的温度调至将恒温水浴箱的温度调至37374040。2)2)从液氮中取出

23、冻存小管，立即投入从液氮中取出冻存小管，立即投入37374040温温 水中快速晃动，直至冻存液完全融解。水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在要在1 12min2min内完成复温。内完成复温。n许多冷冻保护剂（如许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。洗涤冷冻保护剂。n对绝大多数细胞而言，对绝大多数细胞而言，1%1%以下以下之冷冻保护剂之冷冻保护剂DMSODMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中

24、去除，解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。良好后再去除即可。n但对极少数因对但对极少数因对DMSO DMSO 敏感或会造成细胞分化之细敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除胞，需立即去除DMSODMSO。3)3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m15m1培养培养 液，轻轻吹匀。液，轻轻吹匀。4)4)将细胞悬液经将细胞悬液经8008001000 r/min1000 r/min离心离心5min5min。弃上。弃上 清液。清液。5)5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀

25、。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培 养。养。n四、细胞运送四、细胞运送n一是用一是用液氮或干冰保存运输液氮或干冰保存运输，效果较好，但需用特，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦适于空运，比较麻烦。n二是二是充液法运输充液法运输，比较简便，比较简便。充液法运输操作如下：充液法运输操作如下：1.1.选生长状态良好的细胞，待达选生长状态良好的细胞，待达80%80%或或90%90%汇合时，汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部颈部(过满易污染过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落2.2.妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响地的情况下，对细胞活力无严重影响;3.3.到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置3737培养箱中，次日传代。培养箱中，次日传代。