《发酵培养技术》PPT课件

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1、第第4章章 发酵培养技术发酵培养技术固体发酵固体发酵液体发酵液体发酵厌氧发酵厌氧发酵耗氧发酵耗氧发酵发酵发酵按培养基的形式按培养基的形式按微生物对氧的需求按微生物对氧的需求分批发酵分批发酵补料分批补料分批发酵发酵半连续半连续发酵发酵连续连续发酵发酵发酵培养技术发酵培养技术恒化器恒化器 反馈恒化器反馈恒化器 多级连续发酵多级连续发酵 细胞循环连续发酵细胞循环连续发酵 4.1 4.1 分批发酵分批发酵 分批发酵是分批发酵是指在一封闭培养系统中含有初始限制指在一封闭培养系统中含有初始限制量的基质的发酵方式。即种子接种到培养基中后，量的基质的发酵方式。即种子接种到培养基中后，除了气体流通外发酵液始终留

2、在发酵罐中，直至除了气体流通外发酵液始终留在发酵罐中，直至发酵结束。发酵结束。图图3-1 分批培养的典型生长曲线分批培养的典型生长曲线停滞期停滞期加速期加速期对数期对数期减速期减速期平衡期平衡期死亡期死亡期分批发酵过程分批发酵过程一、停滞期一、停滞期即刚接种后的一段时间内，因菌种对新的生长环境有即刚接种后的一段时间内，因菌种对新的生长环境有一适应过程，细胞数目和菌量不变的一适应过程，细胞数目和菌量不变的过程过程。其其长短长短主要取决于种子的活性、接种量、培养基的可利主要取决于种子的活性、接种量、培养基的可利用性和浓度。一般种子采用对数生长期且达到一定浓度用性和浓度。一般种子采用对数生长期且达到

3、一定浓度的培养物，该种子能耐含高渗化合物和低的培养物，该种子能耐含高渗化合物和低CO2分压的培分压的培养基。养基。工业生产从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑，工业生产从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑，应应尽量缩短适应期尽量缩短适应期。这可通过使用合适的种子和提高这可通过使用合适的种子和提高接种量来达到。接种量来达到。二、二、加速加速期期通常很短，比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。通常很短，比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。三、三、对数对数期期当细胞已完全适应其周围环境后，便进入恒定的对数或当细胞已完全适应其周围环境后，便进入恒定的对数或指数生长期指数生长期 比生长速率比生长速

4、率达最大，且为一常数，可用达最大，且为一常数，可用 m表示。表示。可用下式可用下式表示：表示：dtdXXm1另外，处于对数期的细胞的形态、大小和生理特征比较一另外，处于对数期的细胞的形态、大小和生理特征比较一致，细胞内蛋白质、核酸等大分子组成保持不变，新陈代致，细胞内蛋白质、核酸等大分子组成保持不变，新陈代谢旺盛。谢旺盛。对对数生长期的长短主要取决于培养基，包括溶氧的可利数生长期的长短主要取决于培养基，包括溶氧的可利用性和有害代谢产物的积累。用性和有害代谢产物的积累。对数期越长，最后获得的对数期越长，最后获得的活菌数就越多，因此，生产上通常应尽可能地延长对数活菌数就越多，因此，生产上通常应尽可

5、能地延长对数生长期。生长期。四、四、减速期减速期随着养分的减少，有害代谢物的积累，生长不可能再无随着养分的减少，有害代谢物的积累，生长不可能再无限制地继续。这时虽然细胞量仍旧在增加，但其比生长限制地继续。这时虽然细胞量仍旧在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化。减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力(Ks)，亲，亲和力高，即和力高，即Ks值小，则减速期短。值小，则减速期短。五、平衡五、平衡期期实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生长速率等于实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生长速率等于零

6、，即零，即 (为比死亡速率为比死亡速率)。由于此时菌体的次级代。由于此时菌体的次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此时大量合成，菌的谢十分活跃，许多次级代谢产物在此时大量合成，菌的形态也发生较大的变化形态也发生较大的变化(如菌体分化，染色变浅，形成空如菌体分化，染色变浅，形成空胞等胞等)。六、死亡六、死亡期期当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期。这时。进入死亡期。这时。，生长呈负增长。工业发酵一，生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。发酵周期的长般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。发酵周期的长短不仅取决

7、于前面五期的长短还取决于短不仅取决于前面五期的长短还取决于X0。七、分批发酵过程产物的形成动力学七、分批发酵过程产物的形成动力学dtdPXqP1产物比生成速率产物比生成速率单位质量菌体细胞在单位时间内所能生成的产物的量单位质量菌体细胞在单位时间内所能生成的产物的量产物形成动力学产物形成动力学生长耦联型生长耦联型 非生长耦联型非生长耦联型 混合生长耦联型混合生长耦联型 XPPYdtdPXq/1微生物分解基质途径微生物分解基质途径的直接产物和某些酶的直接产物和某些酶类，如酒精、黑曲霉类，如酒精、黑曲霉葡萄糖氧化酶和根霉葡萄糖氧化酶和根霉脂肪酶，其产物浓度脂肪酶，其产物浓度与菌体生长随时间的与菌体生

8、长随时间的变化呈平行关系变化呈平行关系 dtdPXqP1产物的形成速度与菌产物的形成速度与菌体生长速率无关，而体生长速率无关，而与菌体量的多少有关。与菌体量的多少有关。如次生代谢产物如次生代谢产物 PqLuedeking-Piret方程方程。如乳酸、黄原胶和一如乳酸、黄原胶和一些次生代谢产物发酵些次生代谢产物发酵 图图3-2 分批发酵生长与产物形成的动力学模型分批发酵生长与产物形成的动力学模型.(a)生长生长耦联型；耦联型；(b)混合生长耦联型；混合生长耦联型；(c)非生长耦联型非生长耦联型 当产物为生长耦联型时，当产物为生长耦联型时，则延长与产物合成有关的则延长与产物合成有关的对数生长期；对

9、数生长期；当产物为非生长耦联型时，当产物为非生长耦联型时，如次生代谢产物，则以如次生代谢产物，则以缩短菌体的对数生长期，并迅速获得足够量的菌体缩短菌体的对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长生产期，以提高产量；细胞后延长生产期，以提高产量；当产物为混合生长耦联型时，当产物为混合生长耦联型时，则根据其耦联程度而则根据其耦联程度而灵活调节。灵活调节。八、分批发酵过程中基质的消耗动力学八、分批发酵过程中基质的消耗动力学A.得率系数得率系数细胞对基质的得率系数细胞对基质的得率系数YX/S：SXYSX细胞对氧的得率系数细胞对氧的得率系数YX/O：2OXYOX产物对基质的得率系数产物对基质的得率系数

10、YP/S：SPYSP当限制性基质为碳源时，消耗掉的碳源一部分用于形成当限制性基质为碳源时，消耗掉的碳源一部分用于形成细胞物质，一部分形成产物，一部分产生能量供细胞维细胞物质，一部分形成产物，一部分产生能量供细胞维持生命活动，对其进行质量衡算可得，则持生命活动，对其进行质量衡算可得，则B.基质消耗速率基质消耗速率基质的消耗细胞生长所耗基质产物生成所耗基质的消耗细胞生长所耗基质产物生成所耗 基质细胞维持生命活动所耗基质基质细胞维持生命活动所耗基质 即即dtdSdtdSdtdSdtdSmPG若用一些得率系数来表示，则，若用一些得率系数来表示，则，YG 细胞的得率系数；细胞的得率系数；YP 产物得率系

11、数；产物得率系数；m 维持系数维持系数GGdSdXY PPdSdPY dtdSXmm1mXdtdPYYXdtdSPG1上式为基质消耗速率方程。上式为基质消耗速率方程。YX/S、YP/S 是对碳源的总消是对碳源的总消耗而言，而耗而言，而YG、YP 则分别是对用于生长和用于产物生则分别是对用于生长和用于产物生成所消耗的碳源而言。成所消耗的碳源而言。即即代入上式，则，代入上式，则，mXdtYdPXdtYXdXmXdtYdPdtYdXdtdSdtdSdtdSdtdSPGPGmPG如果用比速率来表示基质消耗和产物生成：如果用比速率来表示基质消耗和产物生成：dtdSXqS1dtdPXqP1基质比消耗速率基

12、质比消耗速率产物比生成速率产物比生成速率因此，基质消耗速率方程也可表示为因此，基质消耗速率方程也可表示为mYqYqPPGSmXdtdPYYXdtdSPG1当产物生成可忽略不计时，则当产物生成可忽略不计时，则mYqGS根据根据qS的定义有：的定义有：SXSYdtdXXdXdSdtdSXq111合并上面两式，则，合并上面两式，则，mYYGSX11因此，测定细胞在不同比生长速率时下的因此，测定细胞在不同比生长速率时下的YX/S，根，根据上式的据上式的1/YX/S 对对1/作图，就作图，就可求出可求出m 和和YG。4.2 4.2 补料分批发酵补料分批发酵 补料分批发酵又称为流加分批发酵补料分批发酵又称

13、为流加分批发酵(fed-batch)，是指在，是指在分批发酵过程中，间隙或连续的补加新鲜培养基的培养分批发酵过程中，间隙或连续的补加新鲜培养基的培养技术。由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液技术。由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液的体积在不断增加。其目的是克服由于养分的不足，导的体积在不断增加。其目的是克服由于养分的不足，导致发酵过早结束。致发酵过早结束。补料分批发酵与分批发酵相比，其补料分批发酵与分批发酵相比，其优点优点在于能使发酵系在于能使发酵系统中维持很低的基质浓度，导致统中维持很低的基质浓度，导致1)可以可以除去除去快速利用快速利用碳碳源的阻遏效应源的阻遏效应，即葡萄糖效

14、应，并维持适当的菌体浓度，即葡萄糖效应，并维持适当的菌体浓度，不致于加剧供氧的矛盾；不致于加剧供氧的矛盾；2)避免有毒代谢副产物的积累避免有毒代谢副产物的积累。其其应用范围应用范围十分广泛，包括各种产物的发酵。近年来尤十分广泛，包括各种产物的发酵。近年来尤其在基因工程菌的高密度发酵中，其优势更加明显。其在基因工程菌的高密度发酵中，其优势更加明显。4.3 4.3 半连续发酵半连续发酵 1.概念概念在补料分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液在补料分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液(行行业中称为带放业中称为带放)便可称为半连续发酵。便可称为半连续发酵。2.优点优点可补入适当的养分或前体可补入适

15、当的养分或前体；代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成；避免代谢终产物的反馈抑制作用。避免代谢终产物的反馈抑制作用。放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体；旺盛期的菌体；定期补充和带放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体定期补充和带放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大；积更大；发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成；制发酵产物的合成；一些经代谢产生的前体可能丢失；一些经代谢产生的前体可能丢失；有利于非产生菌突变株的

16、生长。有利于非产生菌突变株的生长。3.缺点缺点4.4 4.4 连续发酵连续发酵 1.概念概念连续培养是发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相连续培养是发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相同的流速放料，维持发酵液原来的体积。同的流速放料，维持发酵液原来的体积。2.种类种类恒化器恒化器 反馈恒化器反馈恒化器 多级连续发酵多级连续发酵 细胞循环连续发酵细胞循环连续发酵 继续继续稀释速率：稀释速率：D=F/V XXVFXXVFdtdX0在稳态条件下，在稳态条件下，dX/dt=0，上式变为：，上式变为：DVF因此，在稳态下可通过控制补料速率来控制比生因此，在稳态下可通过控制补料速率来控制比生长速率。这

17、是恒化器的最重要的特性之一。长速率。这是恒化器的最重要的特性之一。稳态时放掉发酵液中的细胞量等于生成细胞量稳态时放掉发酵液中的细胞量等于生成细胞量 恒化器恒化器 返回返回是一种通过调节补料速率来保持生长参数为一恒定是一种通过调节补料速率来保持生长参数为一恒定值的连续发酵。稀释率和比生长速率便得到相应的值的连续发酵。稀释率和比生长速率便得到相应的调节。包括细胞密度调节。包括细胞密度(混浊度混浊度)、pH、溶解氧、排气、溶解氧、排气中的中的CO2、营养和产物浓度等。、营养和产物浓度等。反馈恒化器反馈恒化器 返回返回即在培养液排出时将细胞截留然后再将其返回罐内。即在培养液排出时将细胞截留然后再将其返

18、回罐内。细胞截留方法有过滤、沉淀、离心和固定化等。也细胞截留方法有过滤、沉淀、离心和固定化等。也可分为外部循环和内部循环两种。其中最常见的是可分为外部循环和内部循环两种。其中最常见的是膜分离技术与发酵的耦合。膜分离技术与发酵的耦合。细胞循环连续发酵细胞循环连续发酵 其主要优点是：其主要优点是：可充分利用仍旺盛的菌体细胞；可充分利用仍旺盛的菌体细胞；降低产物的浓度，消除其反馈抑制作用；降低产物的浓度，消除其反馈抑制作用；1)1)降低代谢副产物的浓度，消除其对细胞和代谢降低代谢副产物的浓度，消除其对细胞和代谢的毒性作用。的毒性作用。返回返回是在恒化器中增加罐的个数的一种连续发酵。其是在恒化器中增加

19、罐的个数的一种连续发酵。其优点是可在不同级的罐内可控制不同的条件，以优点是可在不同级的罐内可控制不同的条件，以满足不同时期的菌种的代谢活动要求。在多种碳满足不同时期的菌种的代谢活动要求。在多种碳源的利用和次生代谢产物的生产中其优点更加明源的利用和次生代谢产物的生产中其优点更加明显。显。多级连续发酵多级连续发酵 发酵培养技术有哪些？各种技术的特点是什么？发酵培养技术有哪些？各种技术的特点是什么？分批培养过程微生物细胞生长经历了哪几个阶段？分批培养过程微生物细胞生长经历了哪几个阶段？各自的特点是什么？各自的特点是什么？分批发酵中产物的形成从动力学角度有几种类型？分批发酵中产物的形成从动力学角度有几种类型？各自的特点是什么？各自的特点是什么？名词解析：比生长速率、基质比消耗速率、产物比名词解析：比生长速率、基质比消耗速率、产物比生成速率、对基质的细胞得率系数、对基质的产物得生成速率、对基质的细胞得率系数、对基质的产物得率系数、基质消耗速率方程、率系数、基质消耗速率方程、Luedeking-Piret方程。方程。思思 考考 题题