第五章非水酶学

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1、 第一节第一节 非水酶学中的反应介质非水酶学中的反应介质 酶反应在有机介质中进行，已经成为酶工酶反应在有机介质中进行，已经成为酶工程、酶化工研究的一个新的领域，开辟了一程、酶化工研究的一个新的领域，开辟了一个新的研究方向。个新的研究方向。由于酶的组成、结构、构象多样化，所以由于酶的组成、结构、构象多样化，所以不是所有的酶不是所有的酶都可以在有机介质中反应。都可以在有机介质中反应。酶是否适于在有机介质中反应，除与酶酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关外，还取决于酶性质有关外，还取决于酶-底物、产物底物、产物-溶剂溶剂间的关系问题。间的关系问题。这完全需要用实验来决定这完全需要用实验来决定

2、。用于酶催化的用于酶催化的非水介质非水介质包括包括:含微量水的有机溶剂；含微量水的有机溶剂；与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系；与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系；水与有机溶剂形成的两相或多相体系；水与有机溶剂形成的两相或多相体系；胶束与反胶束体系；胶束与反胶束体系；超临界流体；超临界流体；气相。气相。它们不同于它们不同于标准的水溶液体系标准的水溶液体系。在这些体系中。在这些体系中水含量受到不同程度的水含量受到不同程度的严格控制严格控制，因此又称为，因此又称为非常规介质非常规介质（nonconventional media）一、一、非水介质中酶的结构非水介质中酶的结构 在有机溶剂中，酶分子

3、不能直接溶于其中，在有机溶剂中，酶分子不能直接溶于其中，它的存在状态有多种形式。主要分为它的存在状态有多种形式。主要分为两大类两大类。第一类为第一类为固态酶固态酶，它包括，它包括冷冻干燥的酶粉冷冻干燥的酶粉或或固定化固定化酶、结晶酶，酶、结晶酶，它们以固体形式存在有机溶剂中。它们以固体形式存在有机溶剂中。第二类为第二类为可溶解酶，可溶解酶，它主要包括它主要包括水溶性大分子共价水溶性大分子共价修饰酶修饰酶和非共价修饰的和非共价修饰的高分子高分子-酶复合物、表面酶复合物、表面活性剂活性剂-酶复合物酶复合物以及以及微乳液中的酶微乳液中的酶等。等。酶不溶于酶不溶于疏水性有机溶疏水性有机溶剂，它在含剂，

4、它在含微微量水量水的有机溶的有机溶剂中以悬浮状剂中以悬浮状态起催化作态起催化作用用。二、二、非水介质中酶的性质非水介质中酶的性质 酶在有机溶剂中能够保持其酶在有机溶剂中能够保持其整体结构整体结构及及活性活性中心结构中心结构的完整，因此它能发挥的完整，因此它能发挥催化功能催化功能。但由于介质的改变，下列方面可能但由于介质的改变，下列方面可能受到影受到影响：响：1、热力学稳定性、热力学稳定性 有机溶剂中酶的有机溶剂中酶的热稳定性热稳定性和和储存稳定性储存稳定性都比都比水溶液中水溶液中高高。例如：例如：猪胰脂肪酶（猪胰脂肪酶（PPL）在苯中催化酯交换反应时，在苯中催化酯交换反应时，（1）酶活性随温度

5、升高（）酶活性随温度升高（2070）而增加，）而增加，（2）在）在70连续反应连续反应7次（每次次（每次96 h）后酶活力仍）后酶活力仍保持保持 60，（3）PPL在有机溶剂中在有机溶剂中 100时的半衰期可达数时的半衰期可达数十小时十小时 在水中在水中100几乎马上失活几乎马上失活 PPL的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度，的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度，1的水，会使的水，会使PPL的稳定性降低到和水溶液中的稳定性降低到和水溶液中相同的水平。相同的水平。2、底物特异性、底物特异性 酶在有机溶剂中对底物的酶在有机溶剂中对底物的化学结构化学结构和和立体结构立体结构均有严格的均有严格的选择性选择性

6、。例如：例如：青霉脂肪酶青霉脂肪酶 在正己烷中催化在正己烷中催化2-辛醇辛醇与不同链长的与不同链长的脂脂肪酸肪酸进行酯化反应时，该酶对进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸短链脂肪酸具有较强的特异性，这与它催化甘油三酯具有较强的特异性，这与它催化甘油三酯水解是相同的。水解是相同的。介质改变时，酶的介质改变时，酶的底物专一性（底物专一性（kcat/Km）和和催化效率催化效率会发生改变。会发生改变。底物在反应介质与酶活性中心之间底物在反应介质与酶活性中心之间分配的分配的变化变化也是影响酶的底物专一性及其催化效率也是影响酶的底物专一性及其催化效率的因素之一。的因素之一。3、对映体选择性、对映体选择性 酶的

7、对映体选择性是指酶识别酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化外消旋化合物合物中某种构象对映体的能力。中某种构象对映体的能力。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变。疏水性强疏水性强的有机溶剂中酶的的有机溶剂中酶的立体选择性差立体选择性差。例如：某些例如：某些蛋白水解酶蛋白水解酶在有机溶剂中可以合在有机溶剂中可以合成成D氨基酸的肽氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸氨基酸。4、位置选择性、位置选择性 有机溶剂中的酶催化还具有位置选择有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性，即酶

8、能够选择性地催化底物中性，即酶能够选择性地催化底物中某个某个区域的基团区域的基团发生反应。发生反应。5、化学键选择性、化学键选择性 化学键的选择性是非水介质中酶催化学键的选择性是非水介质中酶催化的一个化的一个显著特点显著特点。6、pH记忆记忆 有机溶剂中的酶有些能够有机溶剂中的酶有些能够“记忆记忆”它它冷冻干燥冷冻干燥或或丙酮沉淀丙酮沉淀前前所在缓冲液中所在缓冲液中的的pH，这种现象为，这种现象为“pH记忆记忆”。实质内容是：实质内容是：（1）酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液）酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的pH密切相关，密切相关，（2）反应的最适）反应的最适pH接近于水溶液中的最接近于水

9、溶液中的最适适pH。二、水（一）水存在的方式（一）水存在的方式 在有机溶剂中酶的催化活力与反应系统在有机溶剂中酶的催化活力与反应系统的含水量密切相关。系统中含水量包括：的含水量密切相关。系统中含水量包括：1、与酶粉水合的、与酶粉水合的结合水结合水，（，（必需水必需水）2、溶于有机溶剂中的、溶于有机溶剂中的自由水自由水，3、固定载体和其他杂质的、固定载体和其他杂质的结合水结合水。与酶结合的水量是影响与酶结合的水量是影响酶的活力酶的活力、稳定稳定性性以及以及专一性专一性的决定因素。的决定因素。控制酶结合的水量控制酶结合的水量（必需水必需水）和水在酶和水在酶分子中的位置是分子中的位置是关键关键。（二

10、）保证必需水含量（二）保证必需水含量 水是保证酶催化反应的必需条件水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是水分子直接或间接由氢键等活性构象是水分子直接或间接由氢键等非共价键相互作用来维持。非共价键相互作用来维持。因此因此水与酶分子紧密结合的一单层水水与酶分子紧密结合的一单层水分子分子对催化作用非常重要。而其他的水对催化作用非常重要。而其他的水则相对不那么重要则相对不那么重要(即由有机介质替代的即由有机介质替代的那部分水不那么重要了）。那部分水不那么重要了）。必需水必需水：是维系酶构象稳定和酶催化是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分活性所必需的那部分最少量的水分子最少量的水分子,有有时也叫

11、时也叫结合水结合水。只要那部分必需水不丢只要那部分必需水不丢失失,其他的大部分水可以由有机溶剂代其他的大部分水可以由有机溶剂代替。替。如：有的酶反应即使如：有的酶反应即使水只占水只占0.015%0.015%，酶仍然有活性，可以进行酶反应酶仍然有活性，可以进行酶反应,而且而且反应速度非常快。反应速度非常快。胰脂肪酶的胰脂肪酶的反应速度反应速度-水含量水含量的关系图的关系图 酶结合水的过程分酶结合水的过程分4 4步：步：1.1.首先与酶分子表面的首先与酶分子表面的带电基团带电基团结合一部结合一部分水分水(0-0.07g/g(0-0.07g/g(水水/酶酶)。2.2.再与酶分子表面的再与酶分子表面的

12、极性基团极性基团结合一部分结合一部分水水(0.07-0.25g/g(0.07-0.25g/g(水水/酶酶)。3.3.再聚集到表面相互作用再聚集到表面相互作用较弱的部位较弱的部位(0.25-0.38g/g(0.25-0.38g/g(水水/酶酶)。4.4.最后酶分子表面最后酶分子表面完全水合化完全水合化，水分子覆，水分子覆盖酶分子表面。盖酶分子表面。（三）必需水含量问题：（三）必需水含量问题：因因酶分子本身、溶剂系统酶分子本身、溶剂系统不同而有所不同。不同而有所不同。如：脂肪酶有几个水分子如：脂肪酶有几个水分子,胰凝乳蛋白酶几十个水分子胰凝乳蛋白酶几十个水分子,乙醇脱氢酶、多酚氧化酶有几百个水分子

13、。乙醇脱氢酶、多酚氧化酶有几百个水分子。同一个酶在不同溶剂系统中含水也不同。同一个酶在不同溶剂系统中含水也不同。如：胰凝乳蛋白酶，如：胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水在甲苯中，含水0.5%0.5%，酶活性最高，酶活性最高，氯仿等系统中，含水氯仿等系统中，含水1.0%1.0%，酶活性最高。，酶活性最高。三、有机溶剂 有机溶剂不但直接或间接地影响有机溶剂不但直接或间接地影响酶的酶的活力活力和和稳定性稳定性，而且也能够改变，而且也能够改变酶的特酶的特异性异性（包括底物特异性、立体选择性、（包括底物特异性、立体选择性、前手性选择性等）。通常有机溶剂通过前手性选择性等）。通常有机溶剂通过与与水、酶、底物和产

14、物水、酶、底物和产物的相互作用来影的相互作用来影响酶的这些性质。响酶的这些性质。1、有机溶剂对、有机溶剂对酶的结合水酶的结合水的影响的影响（1）一些有机溶剂对酶的结合水）一些有机溶剂对酶的结合水影响较小影响较小，（2）相对亲水性的有机溶剂却）相对亲水性的有机溶剂却能够夺取酶能够夺取酶表面的必需水表面的必需水，从而导致酶的失活，从而导致酶的失活，（3 3）增加酶表面的亲水性增加酶表面的亲水性可以限制酶在有可以限制酶在有机溶剂中的脱水作用。机溶剂中的脱水作用。2、有机溶剂对酶的影响、有机溶剂对酶的影响 （1）有机溶剂以通过改变蛋白分子的）有机溶剂以通过改变蛋白分子的动动态移动性态移动性及及构象构象

15、来影响酶的活力。来影响酶的活力。（2）尽管酶在有机溶剂中整体结构以及）尽管酶在有机溶剂中整体结构以及活性中心的结构都保待完整，但是酶分活性中心的结构都保待完整，但是酶分子本身的子本身的动态结构动态结构及及表面结构表面结构却发生了却发生了不可忽视的变化。不可忽视的变化。（3）溶剂对）溶剂对酶活性中心酶活性中心的的轻微干扰轻微干扰将导将导致酶的催化活性的改变。致酶的催化活性的改变。（4）酶在不同的有机溶剂中）酶在不同的有机溶剂中活力差别很活力差别很大大，酶活力和溶剂的属性之间可能存在，酶活力和溶剂的属性之间可能存在定量的关系。定量的关系。3、溶剂对、溶剂对底物和产物底物和产物的影响的影响（1）溶剂

16、能直接或间接地与底物和产物溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用相互作用，影响酶的活力；，影响酶的活力；（2）溶剂能改变酶分子必需水层中底物或）溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的产物的浓度浓度；（3）底物必须渗入必需水层，产物必须移）底物必须渗入必需水层，产物必须移出此水层，才能使反应进行下去；出此水层，才能使反应进行下去；四、有机溶剂中酶催化活性和选择性的调控 在有机溶剂中酶的催化活性和选择性与反应系在有机溶剂中酶的催化活性和选择性与反应系统的统的水含量、有机溶剂的性质、酶的使用形式水含量、有机溶剂的性质、酶的使用形式（固定化酶、游离酶、化学修饰酶等）、所在缓固定化酶、游离酶、化学修饰酶

17、等）、所在缓冲液的冲液的pH和和离子强度离子强度等因素密切相关，控制和改等因素密切相关，控制和改变这些因素可以提高有机溶剂中的酶活力，调节变这些因素可以提高有机溶剂中的酶活力，调节酶的选择性。酶的选择性。蛋白质工程蛋白质工程和和抗体酶技术抗体酶技术也是改变酶在有机介也是改变酶在有机介质中的催化活性、稳定性和选择性的重要手段。质中的催化活性、稳定性和选择性的重要手段。1、必需水、必需水（1）必需水是酶在非水介质中进行催化反应所）必需水是酶在非水介质中进行催化反应所必需必需的。它直接影响酶的的。它直接影响酶的催化活性和选择性催化活性和选择性。控制控制(水含量）水活度可使酶的催化效率明显水含量）水活

18、度可使酶的催化效率明显提高。提高。只有在最适含水量时，酶才有高的活力只有在最适含水量时，酶才有高的活力和选择性。和选择性。例如：脂肪酶催化拆分例如：脂肪酶催化拆分外消旋外消旋2-辛醇辛醇的反应当的反应当溶溶剂、酶剂、酶等其他因素相对等其他因素相对不变的条件下不变的条件下，可以用，可以用系统含水量系统含水量衡量水对衡量水对酶活性酶活性的影响。的影响。（2）对于）对于生成水生成水的反应（如酯合成和肽合成）的反应（如酯合成和肽合成）体系中水的积累导致酶活力降低，不利于合成体系中水的积累导致酶活力降低，不利于合成反应。向该体系加入分子筛、乙基纤维素等除反应。向该体系加入分子筛、乙基纤维素等除水剂及时水

19、剂及时除去反应生成的水除去反应生成的水，能使酶保持较高，能使酶保持较高活力有利于合成反应的进行。活力有利于合成反应的进行。2、仿水溶剂、仿水溶剂 具有类似水的高介电常数和形成氢键具有类似水的高介电常数和形成氢键能力的这种能力的这种性质性质的其它溶剂。的其它溶剂。例如：二甲基甲酰胺（例如：二甲基甲酰胺（DMF）和乙二醇作）和乙二醇作为辅助溶剂，为辅助溶剂，部分部分或或全部全部替代有机溶剂中替代有机溶剂中的辅助溶剂水。的辅助溶剂水。3、溶剂工程、溶剂工程 溶剂性质影响酶的活性、酶的底物选溶剂性质影响酶的活性、酶的底物选择性、位置选择性和立体选择性。通过择性、位置选择性和立体选择性。通过改变溶剂，可

20、优化到改变溶剂，可优化到酶的最佳状态酶的最佳状态。这。这种技术成为种技术成为“溶剂工程溶剂工程”。选择溶剂应该注意的事项：选择溶剂应该注意的事项：选择合适的溶剂使选择合适的溶剂使酶达到最佳状态酶达到最佳状态溶剂对底物和产物的溶解性要好，能促溶剂对底物和产物的溶解性要好，能促进底物和产物的进底物和产物的扩散扩散溶剂对反应必须是溶剂对反应必须是惰性惰性的的溶剂的溶剂的毒性、成本毒性、成本以及产物从溶剂中以及产物从溶剂中分分离、纯化离、纯化等问题。等问题。4、印迹酶、印迹酶 利用酶与配体的相互作用，诱导、改利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其变酶的构象，制备具有结合该配

21、体及其类似物能力的类似物能力的“新酶新酶”，这是修饰改造，这是修饰改造酶的一种方法。酶的一种方法。根据酶在有机溶剂中具有根据酶在有机溶剂中具有”刚性刚性”结结构的特点，巧妙地发展了这种修饰酶的构的特点，巧妙地发展了这种修饰酶的技术。技术。酶酶+配体配体 沉淀、干燥沉淀、干燥 去掉配体去掉配体 印迹酶（在有机相应用，活力高）印迹酶（在有机相应用，活力高）（在水相中相同）（在水相中相同）“D-型印迹酶型印迹酶”“L-型印迹酶型印迹酶”对 于对 于“D-型 印 迹 酶型 印 迹 酶”，水 含 量，水 含 量1mmol/L时酶活力最高，大于此量时，时酶活力最高，大于此量时，随着水含量的增加酶失去催化随

22、着水含量的增加酶失去催化“D型型”的的活力。控制好活力。控制好“印迹酶印迹酶”在有机溶剂中在有机溶剂中的的最适含水量最适含水量，可以调节和控制酶催化，可以调节和控制酶催化活性和选择性。活性和选择性。5、化学修饰酶、化学修饰酶 化学修饰可以改变酶的一些理化性质，有利于化学修饰可以改变酶的一些理化性质，有利于酶在有机溶剂中的酶在有机溶剂中的稳定性稳定性。一般认为大多数酶可以在有机介质中反应。但一般认为大多数酶可以在有机介质中反应。但是，是，操作稳定性差操作稳定性差。化学修饰的目的就是要提高。化学修饰的目的就是要提高酶的稳定性。酶的稳定性。化学修饰方法很多，常见聚乙二醇（化学修饰方法很多，常见聚乙二

23、醇（PEG）。）。如如PEG修饰修饰过氧化氢酶过氧化氢酶，然后在有机介质中活性，然后在有机介质中活性显著提高。显著提高。磁性脂肪酶（磁性脂肪酶（磁性颗粒外包磁性颗粒外包PEGPEG修饰的脂肪酶），修饰的脂肪酶），它在有机介质中较稳定，活力也较高，还可在磁它在有机介质中较稳定，活力也较高，还可在磁场中回收。场中回收。例：例：用用谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸内酯谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸内酯合成的合成的糖脂糖脂后修饰超氧化物 歧 化 酶后修饰超氧化物 歧 化 酶（SODSOD）。所得的这种）。所得的这种SODSOD糖脂复合物糖脂复合物变变成成脂溶性脂溶性的酶，而不是水不溶性的。的酶，而不是水不溶性的。S

24、ODSOD糖脂复合物在有机介质中活性高大大糖脂复合物在有机介质中活性高大大高高于在水中的活性，并且它对温度、于在水中的活性，并且它对温度、pHpH、蛋白酶水解等的蛋白酶水解等的稳定性均高于天然稳定性均高于天然SODSOD。用用聚磷酸酯、脂肪酸聚磷酸酯、脂肪酸等修饰等修饰SODSOD，同样，同样得到了适合于有机介质中进行催化反应得到了适合于有机介质中进行催化反应的化学修饰酶的化学修饰酶-SOD-SOD。研究发现化学修饰（采用脱糖基化、研究发现化学修饰（采用脱糖基化、PEGPEG修饰等）能够增加修饰等）能够增加酶的表面疏水性酶的表面疏水性，而疏水性的增加正是提高酶在有机介质而疏水性的增加正是提高酶

25、在有机介质中的溶解性和活力的重要原因。中的溶解性和活力的重要原因。PEGPEG修饰酶在甲苯中的活性比未修饰修饰酶在甲苯中的活性比未修饰酶高酶高1616倍。通过倍。通过酶蛋白甲基化酶蛋白甲基化或或疏水分疏水分子子对酶蛋白的修饰，均可提高酶在有机对酶蛋白的修饰，均可提高酶在有机介质中的溶解性、稳定性和活性。介质中的溶解性、稳定性和活性。6、固定化酶、固定化酶 固定化有许多好处。固定化酶在有机固定化有许多好处。固定化酶在有机溶剂中进行酶反应，必定显示其优越性。溶剂中进行酶反应，必定显示其优越性。酶被吸附或者固定在固相载体（水不酶被吸附或者固定在固相载体（水不溶性）上，就可以对抗有机介质对酶的溶性）上

26、，就可以对抗有机介质对酶的变性能力变性能力，提高反应的速度和对热的敏，提高反应的速度和对热的敏感性。感性。首先，载体通过分配效应剧烈地改变首先，载体通过分配效应剧烈地改变酶所处的微环境中酶所处的微环境中底物和产物的局部浓底物和产物的局部浓度。度。例：在水溶液中，底物例：在水溶液中，底物肉桂醇浓度肉桂醇浓度在在0.1mmol/L0.1mmol/L以上可以上可强烈抑制马肝醇脱氢酶强烈抑制马肝醇脱氢酶活性。活性。现在它在现在它在乙酸丁酯乙酸丁酯中，使用中，使用亲水载体固定化酶亲水载体固定化酶，底物浓度高达底物浓度高达50mmol/L50mmol/L也不会发生抑制作用。也不会发生抑制作用。例：研究几种

27、不同载体的固定化脂肪酶时发现，例：研究几种不同载体的固定化脂肪酶时发现，疏水性琼脂珠载体的固定化效果最好。疏水性琼脂珠载体的固定化效果最好。固定化后脂肪酶在有机介质中的活性比对应酶固定化后脂肪酶在有机介质中的活性比对应酶粉高粉高46.546.5。由于载体上疏水基团的存在，使疏水性由于载体上疏水基团的存在，使疏水性底物在疏水作用下底物在疏水作用下分配到载体周围的浓度高于分配到载体周围的浓度高于反应介质中的浓度，使酶反应速度提高。反应介质中的浓度，使酶反应速度提高。其次，其次，载体影响酶分子上的结合水。载体影响酶分子上的结合水。亲水亲水性高的载体会从溶剂和酶分子中夺取大性高的载体会从溶剂和酶分子中

28、夺取大量的水，造成酶部分失水而降低酶的活量的水，造成酶部分失水而降低酶的活性；亲水性低的载体不足以夺取酶的必性；亲水性低的载体不足以夺取酶的必需水，能保持它的高酶活性。需水，能保持它的高酶活性。再次，通过载体与酶之间形成的再次，通过载体与酶之间形成的多点的结多点的结合作用合作用，可稳定酶的催化活性构象。，可稳定酶的催化活性构象。例：例：-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价共价结合后，在结合后，在乙醇乙醇中的稳定性明显提高，中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的价键数量的增加而增强增加而增强。一般来说，载体要选

29、择一般来说，载体要选择疏水性基质疏水性基质，目，目的是为了有利于在有机溶剂中反应。的是为了有利于在有机溶剂中反应。7、蛋白质工程和抗体酶技术、蛋白质工程和抗体酶技术 蛋白质工程技术和抗体酶蛋白质工程技术和抗体酶技术也是改技术也是改变酶在有机介质中的催化活性、稳定性变酶在有机介质中的催化活性、稳定性和选择性的重要手段之一。和选择性的重要手段之一。定位突变定位突变 用过渡态类似物诱导，制备了具有酶用过渡态类似物诱导，制备了具有酶活性的单克隆抗体活性的单克隆抗体“抗体酶抗体酶”8、温度、温度 由于酶在有机溶剂中的热稳定性由于酶在有机溶剂中的热稳定性好好于于水溶液，因此为了提高酶催化速度可以适水溶液，

30、因此为了提高酶催化速度可以适当提高反应温度。当提高反应温度。通过温度的调控可以有效地提高产率。通过温度的调控可以有效地提高产率。9、pH和离子强度和离子强度 因为在有机介质中的因为在有机介质中的最适最适pH与水溶液与水溶液中的最适中的最适pH的酶反应是一样的，所以在的酶反应是一样的，所以在进行酶的冻干时，可以在最适进行酶的冻干时，可以在最适pH的缓冲的缓冲液中冻干，再进行有机系统的反应。液中冻干，再进行有机系统的反应。这样，可以使酶在有机溶剂中反应这样，可以使酶在有机溶剂中反应的微环境具有溶液酶的的微环境具有溶液酶的最适最适pH环境环境。10、反相胶束中的酶活力的调控、反相胶束中的酶活力的调控

31、 反相胶束中的酶活力与反相胶束中的酶活力与体系组成体系组成（pH、离子强度、含水量和表面活性剂、离子强度、含水量和表面活性剂及有机溶剂的种类和浓度）及有机溶剂的种类和浓度）密切相关。密切相关。体系体系含水量含水量是影响酶活力的重要因素。是影响酶活力的重要因素。第三节 非水介质中酶催化的应用 一、手性化合物的制备一、手性化合物的制备 手性化合物是指那些具有手性化合物是指那些具有旋光性质的旋光性质的化合物化合物，它们的，它们的化学组成相同化学组成相同，但是，但是立立体结构不同体结构不同，而成为恰如人的左右手一，而成为恰如人的左右手一样的对映体，也称为样的对映体，也称为手性分子。手性分子。蝴蝶落在荷

32、兰紫菀蝴蝶的四翅（每侧两个）具有左右对称。卡特兰(Cattleya labiata)的左右对称注意唇瓣（舌）的上部左右并非完全对称 对映体对映体的存在是自然界中的一种普遍现象。的存在是自然界中的一种普遍现象。构成生物体的基本物质，如；构成生物体的基本物质，如；氨基酸、蛋白氨基酸、蛋白质、核酸、糖类质、核酸、糖类等都是等都是手性分子手性分子。药物进入生物体内，不同的对映体显示了药物进入生物体内，不同的对映体显示了不不同的药理作用同的药理作用。许多药物、生理活性物质、农药和除草剂大许多药物、生理活性物质、农药和除草剂大部分是部分是手性化合物手性化合物。手性化合物在功能材料、非线性光电材料、手性化合

33、物在功能材料、非线性光电材料、波导材料、导电高分子等方面也具有重要作用波导材料、导电高分子等方面也具有重要作用 。酶作为生物催化剂可以用于手性化合物的酶作为生物催化剂可以用于手性化合物的合成和拆分。合成和拆分。它具有以下优点：它具有以下优点：1、具有高对映体选择性，副反应少，产物、具有高对映体选择性，副反应少，产物光学纯度和收得率高。光学纯度和收得率高。2、酶催化反应条件温和、无环境污染，、酶催化反应条件温和、无环境污染，酶催化手性化合物的合成酶催化手性化合物的合成是将有潜手性是将有潜手性的化合物和前体通过酶催化反应转化为的化合物和前体通过酶催化反应转化为单一对映体的手性化合物。单一对映体的手

34、性化合物。（一）手性药物（一）手性药物l 手性药物是指只含单一对映体的药物。手性药物是指只含单一对映体的药物。l 在药物分子的两个形态中，只有一个形态的分子在药物分子的两个形态中，只有一个形态的分子是对疾病有疗效的，而与其对称的分子疗效甚微是对疾病有疗效的，而与其对称的分子疗效甚微或不起作用，甚至有毒副作用。普通的药物合成或不起作用，甚至有毒副作用。普通的药物合成可以获得某种分子两种形态的混合物，手性分子可以获得某种分子两种形态的混合物，手性分子的研究目的就是将药物中不起作用的分子形态剔的研究目的就是将药物中不起作用的分子形态剔除，而提高有效成分的纯度。除，而提高有效成分的纯度。很多手性药物的

35、对映体具有不同的药理作用很多手性药物的对映体具有不同的药理作用“反应停反应停”事件事件1961年欧洲出现了孕妇服用年欧洲出现了孕妇服用外消旋体的外消旋体的“反应停反应停”后产生多起畸胎事件和悲剧。后产生多起畸胎事件和悲剧。1961-1970年，近九年努力，庭外达成了和解，年，近九年努力，庭外达成了和解，公司同意支付总额公司同意支付总额1.1亿德国马克亿德国马克的赔偿金。的赔偿金。1992年美国药物和食品管理局（年美国药物和食品管理局（FDA）明确要明确要求一个含手性因素的化学药物，必领说明其二求一个含手性因素的化学药物，必领说明其二个对映体在体内的个对映体在体内的不同生理活性、药理作用和不同生

36、理活性、药理作用和药物代谢动力学等情况。药物代谢动力学等情况。利用手性技术，可以有效地去除药物中不起作利用手性技术，可以有效地去除药物中不起作用或有害的成分，生产出具有单一定向结构的纯手用或有害的成分，生产出具有单一定向结构的纯手性药物。手性药物成分更纯，在治疗疾病时毒副作性药物。手性药物成分更纯，在治疗疾病时毒副作用更小，疗效更好，疗程更短。目前，手性药物的用更小，疗效更好，疗程更短。目前，手性药物的研究已成为国际新药研究的新方向之一，手性技术研究已成为国际新药研究的新方向之一，手性技术也成为国际新药研究最前沿的技术。在国际制药界，也成为国际新药研究最前沿的技术。在国际制药界，手性技术已被广

37、泛应用到消化系统疾病、心血管疾手性技术已被广泛应用到消化系统疾病、心血管疾病、癌症等领域的药物开发上。病、癌症等领域的药物开发上。2002年全球年全球500种种畅销药物中手性化学品药物有畅销药物中手性化学品药物有289种，占种，占59%。并。并呈逐年上升趁势。呈逐年上升趁势。几种药物的酶法拆分几种药物的酶法拆分1 1、-阻断剂类手性药物阻断剂类手性药物 -阻断剂是用于治疗阻断剂是用于治疗高血压高血压和和心肌梗死心肌梗死类类疾病的一种药物，其典型的结构式为：疾病的一种药物，其典型的结构式为：ArOCH2CH(OH)CH2NHR，如：，如：普萘普萘洛尔洛尔(propranolol，俗名，俗名“心得

38、安心得安”)(1)(1)普萘洛尔的酶法拆分普萘洛尔的酶法拆分 以对现有的外消旋普萘洛尔生产工艺的中间体（萘氧氯丙醇)进行拆分较为合理。Berinakatti等在有机溶剂中利用PSLPSL（假单胞菌脂肪酶）对其外消旋体水解。得到了（R）-酯的ee（光学纯度）值大于95。（2 2）环氧丙醇的酶法拆分）环氧丙醇的酶法拆分环氧丙醇是具有3个碳的手性中间体，可以合成-受体阻断剂类药物、冶疗艾滋病的HIV蛋白酶抑制剂、抗病毒药物、具有生物活性的手性甘油磷脂。Vantol等对其丁酸酯在有机溶剂中与两相体系中用PPL（猪胰脂肪酶）进行了酶促拆分。2 2非甾体抗炎剂类手性药物的拆分非甾体抗炎剂类手性药物的拆分

39、非甾体抗炎剂类药物，抑制前列腺素的合成,具有镇痛、解热和抗炎的作用。其活性成分是2-2-芳基丙酸的衍生物芳基丙酸的衍生物如:萘普生萘普生(naproxen，甲氧奈丙酸）布洛芬布洛芬(ibuprofen，异丁苯丙酸）等。萘普生的手性拆分萘普生的手性拆分现已证实，(S)-(S)-萘普生萘普生在体内的抗炎活性是是(R)(R)型的型的2828倍倍，现已有直接用化学法合成光学活性的单一对映体萘普生。意大利的Battistel等用固定于载体Amberlite XAD-7上的脂肪酶脂肪酶(CCL)对萘普生的乙氧乙氧基乙酯基乙酯进行酶法水解拆分，使用500 ml的柱式反应器，在连续进行了1 200 h的反应后

40、，得到了18 kg18 kg的光学纯(S)-(S)-萘普生萘普生，且酶活几乎无甚损失。3 3、5-5-羟 色 胺 拮 抗 物 手 性 药 物 拆 分羟 色 胺 拮 抗 物 手 性 药 物 拆 分 5-5-羟色胺羟色胺(5-HT)(5-HT)是一种涉及到各种精精神病神病、神经系统紊乱神经系统紊乱，如焦虑、精神分裂症和抑郁症的一种重要的神经递质。(R)-MDL(R)-MDL在体内的活力是(S)-MDL(S)-MDL的100倍以上，是以前知名的5-HT拮抗物酮色林的活力的150倍。在制备MDL过程中用有机溶剂酶法拆分其中一个主要手性中间体。拆分如下：转酯化反应中有选择性生成了(R，R)-酯 残留的为

41、(S，S)-醇 4 4其它手性药物的酶法拆分其它手性药物的酶法拆分叔叔-亮氨酸亮氨酸(tert-Leu)(tert-Leu)用于制备一系列抗艾滋病抗艾滋病或抗癌药物抗癌药物的重要中间体。Hoechest等将青霉素酰化酶青霉素酰化酶固定在酚醛树脂上，对其衍生物的选择性还原胺化，即可得到所需的光学异构体。青霉素酰化酶青霉素酰化酶(PA)在工业上被广泛地在工业上被广泛地用于从青霉素制得用于从青霉素制得6APA6APA，作为许多半合，作为许多半合成成-内酰胺类抗生素的内酰胺类抗生素的前体前体。它所体现。它所体现出的出的对苯乙酸基有高度选择性对苯乙酸基有高度选择性的特性，的特性，使其不仅能用于催化青霉素

42、的水解，而使其不仅能用于催化青霉素的水解，而且能用于催化其它的且能用于催化其它的胺、多肽和醇胺、多肽和醇的反的反应。应。药物的立体化学药物的立体化学特性会影响其药效或特性会影响其药效或产生毒性，产生毒性，光学纯手性药物光学纯手性药物的开发广泛地的开发广泛地开展开展，化学法与酶法均具各自的，化学法与酶法均具各自的优势和缺优势和缺陷陷 ，何种方法最佳，则有待研究，何种方法最佳，则有待研究。酶已。酶已在某些手性药物的合成中得到了应用，但在某些手性药物的合成中得到了应用，但对于已知的对于已知的4 0004 000多种酶而言，这些酶中多种酶而言，这些酶中只有极少数，随着蛋白质工程和工业微生只有极少数，随

43、着蛋白质工程和工业微生物的不断发展，更为廉价、稳定、适用于物的不断发展，更为廉价、稳定、适用于多种基质和高度选择性的酶的不断开发，多种基质和高度选择性的酶的不断开发，会使会使酶在手性药物合成中的应用变得更为酶在手性药物合成中的应用变得更为广阔。广阔。（二）旋光性高分子（二）旋光性高分子 聚合物的旋光性来源于聚合物的旋光性来源于两个方面两个方面，一方，一方面是面是单体单元单体单元中含有的手性元素，另一方中含有的手性元素，另一方面则是聚合物分子的面则是聚合物分子的手性构象手性构象，有时又是，有时又是这两者的共同作用。这两者的共同作用。利用水解酶在非水介质中可以合成多利用水解酶在非水介质中可以合成多

44、种手性聚合物。种手性聚合物。例如例如:酶催化酶催化可获得可获得较高的立体选择性较高的立体选择性，而而化学催化化学催化法则能提供法则能提供较高的产率较高的产率，二二者结合者结合在合成手性聚合物的应用上，更在合成手性聚合物的应用上，更能获得较大分子量、较高产率的手性聚能获得较大分子量、较高产率的手性聚合物。合物。（三）其他（三）其他 酶用于有机合成的范围在不断扩大，有机酶用于有机合成的范围在不断扩大，有机相中酶催化可完成的反应有相中酶催化可完成的反应有氧化、还原、脱氨、氧化、还原、脱氨、羟化、甲基化、异构化、开环、卤化羟化、甲基化、异构化、开环、卤化等，其中等，其中许多反应类型可应用于许多反应类型

45、可应用于拆分反应或不对称合成拆分反应或不对称合成。例如：例如：1、利用、利用荧光假单孢菌脂肪酶荧光假单孢菌脂肪酶在疏水有机溶剂中在疏水有机溶剂中进行不对称进行不对称开环反应开环反应2、利用、利用脂肪酶脂肪酶在无水有机溶剂中催化在无水有机溶剂中催化3-3-羟羟基酸甲酯基酸甲酯的分子内酯交换反应合成了具的分子内酯交换反应合成了具有有光学活性的内酯光学活性的内酯。利用该方法也可以利用该方法也可以合成大环内酯合成大环内酯。3、拆分许多、拆分许多其他外消旋化合物其他外消旋化合物如：过氧化物可用下列方法拆分：如：过氧化物可用下列方法拆分：酶促拆分和不对称合成的研究具有酶促拆分和不对称合成的研究具有广阔的应

46、用前广阔的应用前景景，促进化学工业和制药工业的高速发展。，促进化学工业和制药工业的高速发展。二、糖和类固醇的选择性酰化二、糖和类固醇的选择性酰化 糖脂糖脂作为一种生物功能分子和化工原料具作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。有重要价值。高级脂肪酸的糖脂高级脂肪酸的糖脂是一种高效无毒的非离是一种高效无毒的非离子型的表面活性剂，它广泛应用于食品、医子型的表面活性剂，它广泛应用于食品、医药、发酵及石油化工领域。药、发酵及石油化工领域。糖类是多羟基的物质，糖类是多羟基的物质，对其多羟基的位置对其多羟基的位置选择性酯化是有机合成化学中的难题之一。选择性酯化是有机合成化学中的难题之一。利用生物催化剂

47、的高度选择性，可能会利用生物催化剂的高度选择性，可能会迎迎刃而解刃而解。例如：例如：将将脂肪酸脂肪酸及其底物及其底物糖糖共吸附在亲水性载共吸附在亲水性载体硅胶上，进行酶催化体硅胶上，进行酶催化乙酸酐乙酸酐和和乙酸乙乙酸乙烯酯烯酯和单和单糖反应糖反应合成糖脂合成糖脂；利用利用三酰基葡萄糖苷三酰基葡萄糖苷和和三酰基葡萄糖三酰基葡萄糖等等为底物，在有机相中进行酶促为底物，在有机相中进行酶促酯交换酯交换反反应或应或脱酰基脱酰基反应反应制备糖脂制备糖脂 三、三、功能高分子的合成功能高分子的合成 酶催化合成可生物降解高分子。酶催化合成可生物降解高分子。可生物降解高分子是指在一定条件下，可生物降解高分子是指

48、在一定条件下，能被能被生物体侵蚀或代谢而降解生物体侵蚀或代谢而降解的材料。的材料。可生物降解高分子材料在各个领域的应可生物降解高分子材料在各个领域的应用前景非常广阔。用前景非常广阔。传统方法包括天然高分子的改造法、化学合成传统方法包括天然高分子的改造法、化学合成法等。法等。天然高分子的改造法天然高分子的改造法：通过化学修饰和共聚等方通过化学修饰和共聚等方法，对淀粉、纤维素、海藻酸等天然高分子进行法，对淀粉、纤维素、海藻酸等天然高分子进行改性，制备可生物降解的高分子材料。改性，制备可生物降解的高分子材料。化学合成法化学合成法：模拟天然高分子的化学结构，从简模拟天然高分子的化学结构，从简单的小分子

49、出发制备分子链上连有酯基、酰胺基、单的小分子出发制备分子链上连有酯基、酰胺基、肽基的聚合物。肽基的聚合物。生物合成法生物合成法1、聚酯类可生物降解高分子的酶促合成聚酯类可生物降解高分子的酶促合成 聚酯类高分子具有良好的可生物降解聚酯类高分子具有良好的可生物降解性，而且它们的单体易得。性，而且它们的单体易得。酶促合成法酶促合成法（1）利用线性单体的缩合反应可以合成具利用线性单体的缩合反应可以合成具有可生物降解性的聚酯。有可生物降解性的聚酯。（2）利用内酯的开环聚合反应合成具有可利用内酯的开环聚合反应合成具有可生物降解性的聚酯。生物降解性的聚酯。2、聚糖酯类可生物降解高分子的酶促合成聚糖酯类可生物

50、降解高分子的酶促合成 酶法改性天然多糖主要是在聚酯链酶法改性天然多糖主要是在聚酯链上引入糖基，以增强聚合物的生物可降上引入糖基，以增强聚合物的生物可降解性能。解性能。3、酶促合成法与化学合成法的联合使用酶促合成法与化学合成法的联合使用 四、四、用于生产精细化工产品的酶用于生产精细化工产品的酶 目前应用于该领域的酶有目前应用于该领域的酶有脂肪酶、蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶、裂解酶裂解酶等。等。1、脂肪酶、脂肪酶（1）脂肪酶拆分外消旋丁酸缩水甘油酯，制备（）脂肪酶拆分外消旋丁酸缩水甘油酯，制备（R）-丁酸缩水甘油酯已达到工业水平。丁酸缩水甘油酯已达到工业水平。（2）Glaxo Wellcome（Ste

51、venage UK）用脂肪酶）用脂肪酶拆分得到拆分得到(1S,2S)-反反-2甲氧基环已醇，是合成抗甲氧基环已醇，是合成抗生素的重要手性中间体。生素的重要手性中间体。（3）假单孢菌脂肪酶生产）假单孢菌脂肪酶生产R型和型和S型的胺已达到每型的胺已达到每年年100t的规模，是合成农用化学品的手性中间体。的规模，是合成农用化学品的手性中间体。2、蛋白酶蛋白酶 目前，只有枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白目前，只有枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶应用于酶应用于N-酰基氨基酸和氨基酸酯的拆分以及酰基氨基酸和氨基酸酯的拆分以及非天然肽的合成。非天然肽的合成。年产数千吨的天冬甜素前体年产数千吨的天冬甜素前体2-Asp-

52、phe-ome的生产的生产3、脱卤酶、脱卤酶 假单孢菌脱卤酶用于拆分假单孢菌脱卤酶用于拆分2-氯丙酸，这是氯丙酸，这是生产除草剂的有效途径，现有生产规模已达年生产除草剂的有效途径，现有生产规模已达年产产2000t。4、裂解酶裂解酶 裂解酶可以用来催化加成反应产生双键或裂解酶可以用来催化加成反应产生双键或消去一个基团产生一个不饱和键，以此生产手消去一个基团产生一个不饱和键，以此生产手性化合物。性化合物。例如例如：腈（腈（jing）水合酶催化腈与水的加成，产生酰胺。）水合酶催化腈与水的加成，产生酰胺。日本的日本的Nitto以每年以每年1000T以上的规模由丙烯腈生以上的规模由丙烯腈生产了丙烯酰胺。

53、产了丙烯酰胺。Lonza也以每年也以每年3000T的规模从的规模从3腈基吡啶生产腈基吡啶生产了烟酰胺。了烟酰胺。5、氧化还原酶氧化还原酶 氧化还原酶具有高立体选择性，它们常常氧化还原酶具有高立体选择性，它们常常用来引入手性和使前手性化合物转化为手性分子。用来引入手性和使前手性化合物转化为手性分子。在工业上的主要应用是利用其区域选择性。在工业上的主要应用是利用其区域选择性。6、氨基转移酶、氨基转移酶 D-氨基酸转移酶能够从相应的氨基酸转移酶能够从相应的L-氨基酸产生氨基酸产生D-氨基酸。氨基酸。7、D-乙内酰脲酶乙内酰脲酶/D-N-氨基甲酰酶氨基甲酰酶 代表性例子是每年以数千多吨规模生产代表性例

54、子是每年以数千多吨规模生产D-P-羟苯基甘氨酸羟苯基甘氨酸。它用于头孢霉素和青霉素的。它用于头孢霉素和青霉素的半合成。半合成。日本味之素、德国拜耳等公司均用此法生产。日本味之素、德国拜耳等公司均用此法生产。8、有工业应用潜力的生物转化用酶有工业应用潜力的生物转化用酶 天然香兰素来自于葡萄糖香草醛，它的年产天然香兰素来自于葡萄糖香草醛，它的年产量仅有量仅有20 t，而世界每年需求量为，而世界每年需求量为12000t。D-葡萄糖、葡萄糖、D-氨基酸、光学活性醇氨基酸、光学活性醇是许多是许多药物、农药和化工产品的重要中间体。药物、农药和化工产品的重要中间体。生物转化或生物合成具有很大的优越性。生物转化或生物合成具有很大的优越性。例：例：利用重组利用重组E.coli生物合成生物合成D-P-羟基苯丙氨酸羟基苯丙氨酸