蛋白质工程概论

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1、蛋白质工程概论蛋白质工程概论前言v基因工程诞生基因工程诞生1010周年之际著名科学家周年之际著名科学家Kevin Kevin M.UlmerM.Ulmer于于19831983年在年在SCIENCE(VOL.219)SCIENCE(VOL.219)发表了论文发表了论文 Protein Engineering,该文的摘要是该文的摘要是:vThe prospects for protein engineering,including the roles of x-ray crystallography,chemical synthesis of DNA,and computer modeling o

2、f protein structure and folding,are discussed.It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis.Such techniques offer the potential for altering protein structure and functi

3、on in ways not possible by any other method.v该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋白质工程诞生了。白质工程诞生了。v蛋白质工程（蛋白质工程（protein engineeringprotein engineering）研究在过）研究在过去的去的2525年间发展迅速，已取得一批较好成果，年间发展迅速，已取得一批较好成果，并开始应用于医学、农业、轻工等各个领域。并开始应用于医学、农业、轻工等各个领域。v20002000年年6 6月月2626日，人类基因组的工作草图宣日，人类基因组的工作草图宣告完成，并进

4、入了后基因组时代（告完成，并进入了后基因组时代（post-post-genome eragenome era）。）。v后基因组时代，中心任务是揭示基因组及其后基因组时代，中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能，并在此基础上阐所包含的全部基因的功能，并在此基础上阐明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、死亡的基本生物学规律，以及与人类健康和死亡的基本生物学规律，以及与人类健康和疾病相关的生物学问题。疾病相关的生物学问题。一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念 Protein Engineeringv所谓蛋白质工程，就是通过对蛋白质已知结所谓蛋白质

5、工程，就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。与功能的关系。v蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础上，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计上，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发展起来的一

6、个新兴研究领域，它开创了按照展起来的一个新兴研究领域，它开创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期，因此，被誉为第二代遗传工程。新时期，因此，被誉为第二代遗传工程。二、蛋白质工程的基础二、蛋白质工程的基础v（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发 展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据而为蛋白

7、质改造提供了理论依据v（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋白（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段质的改造和生产提供了必要的技术手段（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发展（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发展 为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v1.1.酶的开发利用依赖于蛋白质工程的研发酶的开发利用依赖于蛋白质工程的研发v加酶去污剂加酶去污剂:洗衣粉、漂白分等；洗衣粉、漂白分等；v妨碍酶开发利用的原因主要有：妨碍酶开发利用的原因主要有：v生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯

8、化酶蛋白成本太高；白成本太高；v酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低；而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低；v酶催化活性的最适酶催化活性的最适pHpH值及底物专一性的范围较窄，值及底物专一性的范围较窄，与工业应用的要求有较大差距。与工业应用的要求有较大差距。v因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工的方法，以改善酶蛋白

9、的生物特性，使之适合于工业应用的需求，这就需要利用蛋白质工程对蛋白质业应用的需求，这就需要利用蛋白质工程对蛋白质进行改造。进行改造。v2.2.在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的基础与应用研究中，同样存在着蛋白质结构基础与应用研究中，同样存在着蛋白质结构的改造问题的改造问题v如白细胞介素如白细胞介素-2-2（IL-2IL-2）是一种免疫反应调节）是一种免疫反应调节因子，在医学上具有广泛的用途。结构研究因子，在医学上具有广泛的用途。结构研究证明，证明，IL-2IL-2是由是由133133个氨基酸残基组成的多肽，个氨基酸残基组成的多肽，有有3 3个半胱氨酸，个半

10、胱氨酸，1 1个二硫键，而个二硫键，而125125位上的半位上的半胱氨酸处于游离状态胱氨酸处于游离状态，在分离纯化，在分离纯化IL-2IL-2的过程的过程中，易发生二硫键错配，致使整个多肽活性中，易发生二硫键错配，致使整个多肽活性降低。降低。v定点诱变将编码链上编码定点诱变将编码链上编码125125位半胱氨酸的密位半胱氨酸的密码子码子TGTTGT转换成丝氨酸或丙氨酸的密码转换成丝氨酸或丙氨酸的密码(TCT(TCT或或GCA)GCA)，结果可以避免二硫键的错配，使产，结果可以避免二硫键的错配，使产品品IL-2IL-2的活性的活性提高了提高了7 7倍倍。v再如再如:单克隆抗体是很有希望的疾病治疗用

11、药单克隆抗体是很有希望的疾病治疗用药,但是但是,单克隆抗体技术建立起已有数十年单克隆抗体技术建立起已有数十年,并早并早已认识到其药用价值已认识到其药用价值,但至今应用不佳但至今应用不佳,原因是原因是鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源化改鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源化改造需蛋白质工程才能完成。造需蛋白质工程才能完成。（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据蛋白质改造提供了理论依据v研究表明，蛋白质功能部位的几个氨基酸残研究表明，蛋白质功能部位的几个

12、氨基酸残基决定着蛋白质的功能，但是这几个负责功基决定着蛋白质的功能，但是这几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极其精密的空能的氨基酸残基必须处于一个极其精密的空间状态下才能发挥功能。只有能维持蛋白质间状态下才能发挥功能。只有能维持蛋白质结构域的必须氨基酸及其空间构象不变，其结构域的必须氨基酸及其空间构象不变，其功能域的生物学活性才会保持不变。功能域的生物学活性才会保持不变。v因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪

13、些？改变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功能？能？v蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等。白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等。v1蛋白质晶体学蛋白质晶体学v蛋白质晶体学（蛋白质晶体学（protein crystallographyprotein crystallography）是）是利用利用X X射线衍射法（射线衍射法（X-ray diffraction methodX-ray diffraction method）的原理解释蛋白质晶体中的原子在空间的位的原理解释蛋白质晶体

14、中的原子在空间的位置与排列，并了解其与功能的关系。置与排列，并了解其与功能的关系。v2020世纪世纪5050年代末用年代末用X X射线晶体学方法测定了射线晶体学方法测定了第一个蛋白质第一个蛋白质肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构.v现已有现已有400400多种蛋白质的三维结构被搞清。多种蛋白质的三维结构被搞清。v近年来又发展了近年来又发展了核磁共振（核磁共振（NMRNMR）技术）技术，它，它是确定蛋白质分子在溶液中结构信息广为使是确定蛋白质分子在溶液中结构信息广为使用的方法。核磁共振技术使用较低强度辐射用的方法。核磁共振技术使用较低强度辐射能测定蛋白质分子在流动化液态下的三维结能测定蛋白质分子在流动

15、化液态下的三维结构信息，从而更真实地反映蛋白质在生物环构信息，从而更真实地反映蛋白质在生物环境下的结构信息，并能确定小分子与大分子境下的结构信息，并能确定小分子与大分子复合物的结构。复合物的结构。v2蛋白质动力学蛋白质动力学v线性多肽是如何折叠成具有三维特征的天然结构？线性多肽是如何折叠成具有三维特征的天然结构？蛋白质在与其他物质（蛋白质、核酸或酶的底物等）蛋白质在与其他物质（蛋白质、核酸或酶的底物等）相互作用时，其三维结构又是经历怎样的动态过程相互作用时，其三维结构又是经历怎样的动态过程而发挥其活性？只有了解这些问题，才能预测基因而发挥其活性？只有了解这些问题，才能预测基因水平的改造最终会对

16、蛋白质结构与功能产生何种后水平的改造最终会对蛋白质结构与功能产生何种后果，才能谈得上具有真正意义的分子设计，才能真果，才能谈得上具有真正意义的分子设计，才能真正的理解生命现象。蛋白质动力学正是研究这一课正的理解生命现象。蛋白质动力学正是研究这一课题的。题的。v3.生物信息学生物信息学v生物信息学生物信息学的神速发展为蛋白质动力学的研究提供的神速发展为蛋白质动力学的研究提供了方便有效的技术。了方便有效的技术。v生物信息学是利用计算机控制的生物信息学是利用计算机控制的图像显示系统图像显示系统，把，把所要研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上，分所要研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上，分析哪些残基对

17、析哪些残基对分子内分子内相互作用可能是重要的，哪些相互作用可能是重要的，哪些残基对残基对分子间分子间相互作用可能是重要的。前者通常为相互作用可能是重要的。前者通常为结构的稳定所必需，后者多系分子识别及活性重要结构的稳定所必需，后者多系分子识别及活性重要部位。部位。v然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团，再然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团，再用计算机寻找经过用计算机寻找经过“微扰微扰”后蛋白质分子的能量趋后蛋白质分子的能量趋于极小的状态，预测由于这种替换可能造成的后果。于极小的状态，预测由于这种替换可能造成的后果。（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋（三）基因工程理论和技术的发展，为

18、蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段白质的改造和生产提供了必要的技术手段v1.基因克隆、表达与纯化技术的成熟为提高基因克隆、表达与纯化技术的成熟为提高蛋白质得率提供了重要技术策略蛋白质得率提供了重要技术策略v2.2.定点诱变技术的建立定点诱变技术的建立为改造蛋白质的特性为改造蛋白质的特性提供了技术策略提供了技术策略v稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如相互作用，如肽键、氢键、静电作用、肽键、氢键、静电作用、疏水残基间的疏水残基间的疏水键疏水键以及以及二硫键二硫键等。等。v研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由

19、蛋白质一级研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。生物学活性。v如野生型枯草杆菌蛋白酶的如野生型枯草杆菌蛋白酶的218218位天冬酰胺位天冬酰胺(Asn)(Asn)是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将其变成其变成丝氨酸丝氨酸(Ser)(Ser)，用，用6565的失活半衰期衡的失活半衰期衡量，从量，从5959分钟增到分钟增到223223

20、分钟，酶的稳定性显分钟，酶的稳定性显著增加。著增加。v再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。应用受到严重限制。v枯草杆菌蛋白酶在少量枯草杆菌蛋白酶在少量H H2 2OO2 2作用下很快失活作用下很快失活是由于埋藏在催化部位是由于埋藏在催化部位Ser221Ser221邻近的邻近的Met222Met222氧化成硫氢化物的原因氧化成硫氢化物的原因。v19851985年年WellsWells证明若用其他氨基酸取代证明若用其他氨基酸取代Met222Met222，可以提高酶的氧化稳定性而又保持，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化活性高催化活性。v所

21、谓所谓基因定点诱变基因定点诱变（site-directed site-directed mutagenesismutagenesis），就是在），就是在DNADNA水平上，在体外水平上，在体外试管中通过碱基取代、插入或缺失改变基因试管中通过碱基取代、插入或缺失改变基因DNADNA序列中任何一个（或几个）特定的碱基，序列中任何一个（或几个）特定的碱基，使蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码使蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。定点诱变原理示意图三、蛋白质工程的基本程序三、蛋白质工程的基本程序v该技术综合运用蛋白质的三

22、维结构，结构与功能关该技术综合运用蛋白质的三维结构，结构与功能关系的详细信息，用定点诱变基因的方法直接修饰改系的详细信息，用定点诱变基因的方法直接修饰改变基因，或人工合成基因，从而定向改变蛋白质的变基因，或人工合成基因，从而定向改变蛋白质的结构，使其成为具有人们所希望性能的新型蛋白质，结构，使其成为具有人们所希望性能的新型蛋白质，或者创造自然界不存在的蛋白质。或者创造自然界不存在的蛋白质。蛋白质工程的程序蛋白质工程的程序v分离纯化分离纯化0.11.0mg0.11.0mg纯蛋白质，纯蛋白质，v测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷

23、酸探针同位素标记的寡苷酸探针;v以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体转入噬菌体M13M13系统，用双脱氧末端终止法进行系统，用双脱氧末端终止法进行DNADNA序列分析序列分析;v通过表达载体获得较大量通过表达载体获得较大量(0.11.0(0.11.0克克)该蛋白质用于该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案分子预测性质及改造方案;v通过寡核苷酸通过寡核苷酸M13M13系统定点诱变并分离其突变体，系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化多量突变

24、性蛋白质，分析引入表达载体生产并纯化多量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子。质的分子。v现阶段蛋白质工程急待解决的一个主要现阶段蛋白质工程急待解决的一个主要问题是问题是发展克隆基因的表达方法发展克隆基因的表达方法，即找，即找到理想的宿主表达系统。目前常用的表到理想的宿主表达系统。目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系统各有优缺点。表达系统各有优缺点。细菌表达系统细菌表达系统v细菌表达系统培养方法简

25、单、增殖快、生产细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低成本低;v但缺乏真核细胞特有的加工后处理，而且在但缺乏真核细胞特有的加工后处理，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏。定，易被菌体蛋白酶破坏。酵母表达系统酵母表达系统v酵母表达系统是一个重要的真核表达系统，酵母表达系统是一个重要的真核表达系统，既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录后的修饰，也能进行诱导性分对蛋白质转录后的修饰，也能进行诱导性分

26、泌泌;v但它具有活化的蛋白水解酶类，可降解异体但它具有活化的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。蛋白质，使产品产量降低。昆虫表达系统昆虫表达系统v昆虫表达系统的优点是能较高水平地表达不昆虫表达系统的优点是能较高水平地表达不同动物来源的基因，可以胞内表达，也可以同动物来源的基因，可以胞内表达，也可以进行分泌性表达，能够有效地进行蛋白质的进行分泌性表达，能够有效地进行蛋白质的翻译后加工。翻译后加工。v其主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为其主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫4-54-5天后，天后，细胞就裂解，幼虫即死亡。细胞

27、就裂解，幼虫即死亡。哺乳动物细胞v哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比以前几种表达系统场所，其表达真核基因比以前几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。白。v其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高。因此，和筛选细胞株的周期长，成本较高。因此，选择和建立物美、价廉的表达体系，是蛋白选择和建立物美、价廉的表达体系，是蛋白质工程急需解决的问题。质工程急需解决的问题。