引物合成技术服务常见问答

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1、引物合成常见问题Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种，无论采用 什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的 不同和单个循环用时的多少。(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5- OH的保护基团DMT，获 得游离的5- OH；(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5-OH仍然被DMT保 护，3端被活化与溶液中游离的5-OH发生耦合反应；(3) 封闭：耦合反应中极少数5- OH没有参加反应，用封闭试剂终止 其后继续发生反应；(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。Q2.引物

2、合成如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新 鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的 3羟基。纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方 法有：C18、OPC、PAGE 和 HPLC。定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。储存：分装抽干。Q3合成的引物5端是否有磷酸化?合成的引物5为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进 行5端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5或3端进行磷酸化，需要另外 收费。Q4.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度

3、级别要求一般PCR扩增60 basePAGE诊断PCR扩增 40baseHEPD, PAGEDNA测序20base左右HEPD亚克隆，点突变等根据实验要求定HEPD, PAGE， HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定HEPDPAGE反义核酸根据实验要求定HEPDPAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLCQ5需要合成多少OD数？根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度 配制成100pm

4、ol/ul,称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10- 50pmol/ul。加水的体积(微升)可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下 列方式计算：V (微升)=OD数x 33 x 10000 /引物的分子量 引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一 致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。Q7.如何计算引物的Tm值？引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子 强度有关。长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4C(G +

5、C)+ 2C(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (GC%) - 600/size*公式中，Size二引物长度。Q8 引物(含修饰)的分子量是如何确定的？非修饰的引物的分子量(MW)在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要 估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW二(NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) + (Nx * Wx) + ( NI* WI) +

6、16* Ns - 62.NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod, Wmod分 别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除 以混合数，例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21) /2 = 321.21。Ns为硫代 数目，硫代每个位置增加分子量16。常规碱基分子量BaseMolecular WeightA313.21C289.18G329.21T304.19I314.2U290.17常规修饰基团分子量5 -Biotin405.45

7、3 -TAMARA623.605-(6 FAM)537.463 -Dabsyl498.495 -HEX744.133 -(6 FAM)569.465 -TET675.243 -Amino Modifier C3153.075 -Cy5533.633 -Amino Modifier C7209.185 -Cy3507.593 -Thiol Modifier C3154.12Q9如何溶解引物?干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌 面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或 TE（pH8.0）缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底

8、。溶解引 物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5），引物在这 种条件下不稳定。Q10.如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干 粉。干 粉：运输时常温运输，-20C可以保存一年。储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20C可以保存半年。工作液：常规使用，4C保存，也可-20C保存，但应避免反复冻融。修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。Q11.引物定量不准是怎么回事儿？我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有：（1）定量错误、分装错误、引物抽干或收样过程中意外丢失。这种可能性 有，但是很少，因为作为专

9、业的引物合成公司，我们的生产人员都是经过严格的专 业培训，这种错误是要求谨慎避免甚至杜绝的。一般情况下，引物都有留样备份， 接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题，如确实存在问 题，则可安排重新准备一份。（2）系统误差，我们认为 10%左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度 范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（3）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物 干粉部分丢失。（4）用户没有能够正确理解引物 OD 数的含义，没有能够正确使用分光光度 计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。这种 情况比较常见。例如，验证标2OD

10、引物量是否准确，简单的做法是：加入1 ml水，彻底溶解 混匀后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm，此时 光吸收的读数为0.2。Q12.最长可以合成多长的引物？我们合成过100base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度 不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效 率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最 后的产量很低。Q13.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高？主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自 然低于一般的引物。修饰引物通常需要P

11、AGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰 引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。Q14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?连接反应需要引物的 5磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相 应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载 体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火 的难度较大，退火时需要提高退火温度。Q15.如果测序发现引物突变，是否有补偿？该如何处理？如果出现测序发现引物位置碱基错误的情况，我们可以免费重合一次，没有 其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任，这是国际行规。原因我们在前面已

12、提 到，化学合成效率不可能达到 100%。如果遇到这种情况，首先和我们联系，我们会检查合成序列是否和原始订单 一致，如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找 到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了； 40 个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每 个克隆突变的位点都不一样，正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我 们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不 会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区 域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引

13、物。根据全基因合成的数据，我们的引物能做到2000个碱基的片段，取三个克 隆，其中至少有一个是正确的。Q17.为什么引物的0D260/0D280小于1.5？需要指出的是OD26O/OD28O的比值不能用来衡量引物的纯度。OD26O/OD28O 的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体 引物的OD26O/OD28O的比值，清楚表明0D260/0D280的比值与引物的碱基组成密切 相关。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base CompositionsBase CompositionA26

14、0/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-32.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-31.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-31.155 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT31.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-31.66Q18.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以 嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能 性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色 效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。Q19.如何检测引物的纯度？实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝 胶进行电泳。取0.2-O.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉 直到饱和，上样前加热变性(95C,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样 品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧 光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件 许可，也可以用银染方式染色。