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1、包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备重组蛋白在大肠杆菌、酵母、哺乳动物中的表达可分为三种形式：胞外分泌表达、胞内可溶性表达和胞内不溶性表达（即产物以包涵体形式存在）。以包涵体形式存在的重组蛋白是无生物活性的，需要进行复性处理，然后再进行分离纯化。包涵体纯化与传统生物大分子的分离纯化方法相似，即以分子的等电点、溶解性、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等特征为基础进行纯化。1. 一、常用的包涵体纯化方法金属亲和层析该方法主要利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和金属离子之间的相互作用来进行蛋白纯化。我们在载体构建时可以加上一些亲和性标签（如His标签、GST标签、Flag标签等），以便采取亲和纯化的方式纯化
2、蛋白。利用Ni2+和6xHistag之间的亲和性，通过在蛋白的N端或C端加上610个组氨酸，在一般或变性条件下借助它与Ni2+螯合柱的紧密结合能力，采用咪唑洗脱，或降低PH使组氨酸充分质子化，使其不再与Ni2+结合，从而分离纯化出带有6xHistag的融合蛋白，纯度通常能达到90%以上。2离子交换层析离子交换层析是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离的方法。常用的离子交换剂有羧甲基纤维素（阳离子交换剂，弱酸型）和二乙基氨基乙基纤维素（阴离子交换剂，弱碱型）。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，需要通过提高洗脱液中的盐浓度等措施将其洗脱下来。根据蛋白
3、质结合能力不同，洗脱的速度会存在差异，通常结合较弱的蛋白质先被洗脱。反之，阳离子交换基质会结合带有正电荷的蛋白质，可以通过提高洗脱液的PH或增加洗脱液中的盐浓度将蛋白洗脱下来。交换介质淋洗3凝胶过滤层析凝胶过滤层析通常又称为分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状达到分离和纯化的目的。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。此方法的优点在于层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷并且吸附力弱，可较广的温度范围内进行。先前就有研究报道，用Ni亲和柱层析纯化洗脱的蛋白溶液上样于Superdex-75柱，经过分子筛的纯化，在变性条件下重组蛋白纯度达到95%以上。疏水层析是根据蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的
4、数目和空间分布不同，从而决定是否能与疏水填料结合以达到分离目的。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高浓度盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则不能，由此可以将蛋白质初步分离。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。5.反反胶团相转移技术利用表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成反相胶团，在一定条件下将溶液中的蛋白质分子增溶进反胶团的极性核中，再创造条件将蛋白质抽提至另一水相，实现蛋白质的相转移，从而达到分离的目的。刘京萍等用CTAB/正辛醇：三氯甲烷(4:1V/V)反胶团体系对牛血清白蛋白(BSA)进行相转移，找到了实现牛血清白
5、蛋白分离提纯的有效方法。但是，该项技术还存在一些限制，如从有机相到水相反萃取蛋白时产率相对较低。因此，选择适当的体系及介质条件对提高蛋白反萃取率具有重要的意义。包涵体是外源基因在原核细胞中表达时所形成的不溶性蛋白质颗粒。包涵体蛋白不具有生物活性，所以给需要制备活性蛋白来开展下游实验的科研工作者们带来了诸多不便。那么，如何进行包涵体蛋白制备，如何对包涵体进行复性和纯化，以获得有活性的可溶性蛋白呢，请看下文具体介绍。包涵体蛋白制备步骤：1.包涵体裂解实验人员的蛋白通常来自细菌、哺乳动物细胞和植物细胞等，需要根据蛋白的来源和性质不同选择合适的裂解方法。常见的包涵体蛋白裂解方法有：超声破碎法、溶菌酶处
6、理法、细胞匀浆法、反复冻融法等，前两种方法相对来说更常用一些。超声破碎步骤可参考His标签蛋白纯化，但在超声之前一般要向溶液中加入1%TritonX-100。2. 包涵体洗涤包涵体在裂解之后需要进行洗涤，因为包涵体中除了含有重组蛋白，还含有RNA聚合酶、夕卜膜蛋白等杂质蛋白以及DNA、RNA核酸片段和多糖等。通过洗涤可以除去一些影响重组蛋白活性的杂质。我们可以使用低浓度的变性剂，如2M尿素在50mMTris（pH7.0-8.5）,1mMEDTA中洗涤。或者也可以使用一些温和的去垢剂如TritonX-100、CTAB等，而去垢剂的洗涤能力会随溶液中离子浓度的升高而增加，所以可向溶液中加入较高浓度
7、NaCl。3. 包涵体溶解包涵体蛋白一般只溶于强的变性剂如尿素（浓度68mol/L）和盐酸胍（浓度57mol/L），它是通过打断离子间的相互作用进而打断包涵体蛋白分子内和分子间的各种化学键，从而使多肽能够正常伸展。4.包涵体复性由于包涵体中重组蛋白的高级结构被破坏，失去生物活性，所以需要采取恰当的复性方式使蛋白能够正确折叠。蛋白的复性可以说是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。由于不同蛋白的性质存在差异及所处环境不一，其复性条件也就大不相同。通常一个蛋白都会有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白能够正确折叠，才有利于进一步的分离纯化。常用的蛋白复性方法:就点触点稀題性直接初
8、入水或复性編中液以降低变性剂浓度从而使至白能够更新折程摄作简单易沉淀；速度不易控制；体积大增加较丸后续址理囲堆透析复性通过谡斷降陽卜透液浓度来控制变性剂去除逗度揑制折普，超进行；不增力咻积易沉定不适台大规模按作；周朝长超滤复性遥择含适戟留分子量的腥，兌许变性剂通过膜而雷白质无:疑过生产中便用较我规模较犬；易于对還析速度进厅控制不适合样品显转少的情况；有些蚩白在超馳稈中閱生不可逆的变性吐夏性通过将目标蚩白结含到层析柱上.减少蛋白分子间的相巨彩匝L常用于复性的层析方:殖5EUHI匚霜腥析等負性回收率贰快底易战犬；样品稀释倍数小5.包涵体纯化包涵体复性以后可以采取与可溶性蛋白相似的方法，包括金属亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析等。技术线路图：
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备
