第8章菌种退化和保藏课件

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1、第8章菌种退化与保藏n第一节菌种的退化与防止第一节菌种的退化与防止n一、菌种退化一、菌种退化(degeneration)n生产菌种或优良菌种由于传代或保藏之后，生产菌种或优良菌种由于传代或保藏之后，群体中的某些生理特性或形态特征减退或群体中的某些生理特性或形态特征减退或消失。消失。二、菌种退化的原因n1、基因突变是主要原因n2、连续传代是加速退化的直接原因n3、培养条件和保藏条件有多方面的影响n(1)不同环境条件n(2)培养基n(3)培养条件n(4)保藏条件三、菌种退化的防止n1、减少传代n2、用单核细胞和单菌落传代n3、经常进行菌种纯化n4、采用良好的培养基和培养条件n5、科学的保藏方法四、

2、菌种复壮n1、菌种复壮：通过自然分离的方法将那些尚未弃衰退的细胞从群体中分离出来，使菌种的优良性壮得以恢复。是一种消极的措施。n2、积极措施：在尚未退化前，经常进行自然分离。第二节第二节 工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术n 在生产发酵中，具有高产有重要经济价在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。工业发酵过程极为重要。一、保藏方法应具备的条件一、保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证

3、高产突变株不改变表型和基因型，保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。二、工业微生物菌种保藏技术二、工业微生物菌种保藏技术 (1)冷冻干燥或真空干燥保藏；冷冻干燥或真空干燥保藏；(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏；(3)转接培养或斜面传代保藏；转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。2.12.1 冷冻保藏冷冻保藏 n冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简

4、单而有效的冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。方法。n通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。n冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类冷冻保藏种类 1、普通冷冻保藏技术、普通冷冻保藏技术(-20

5、)2、超低温冷冻保藏技术、超低温冷冻保藏技术(-60一一-80)3 3、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术1 1、普通冷冻保藏技术、普通冷冻保藏技术(-20)(-20)n将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于冰箱的冷藏室中，或到试管或指管内，然后贮藏于冰箱的冷藏室中，或于温度范围在于温度范围在-5-5-20-20的普通冰箱的普通冰箱(-20)(-20)中。或中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上长适度后，将试管或瓶口用橡

6、胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。置于冰箱中保存。n用此方法可以维持若干微生物的活力用此方法可以维持若干微生物的活力1 12 2年。年。注意！注意！n应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。用来保藏。n保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。管应严格密封。n这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。长期保藏。2 2、超低温冷冻保藏技术、超低温冷冻保藏技术 (-60(-60至至-80)-80)n要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在要求长期保藏的

7、微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。以下进行保藏。n在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法：在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法：n1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；n2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；n3加入等体积的加入等体积的20甘油或甘油或10二甲亚砜；二甲亚砜；n4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。超低温冰箱中保藏。n n如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含含1010甘油的新配制液体培养基洗涤收甘油的新配制液体培养

8、基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-21-2minmin。干细菌和真菌菌种可通过。干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏此保藏方法保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。3 3、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术 (1)冷冻保护剂冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜二甲亚砜5。所使用的甘油。所使用的甘油般用高压蒸汽灭般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。(2)(2)液氮冷冻

9、保藏微生物菌种的步骤液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1 1待冷冻保藏菌种悬液的制备待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml5ml含含1010甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；成孢子及菌体细胞悬液；0.50.5lmllml分装玻璃安瓿或分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。液氮冷藏专用塑料瓶。(2)(2)从浸没培养物制备菌悬液：从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积在浸没培养液中加入等体积20%20%无菌甘油；无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较

10、紧，则轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；需先用玻璃珠打散；0.5-lml0.5-lml分装玻璃安瓿或液分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于将所有封好的安瓿置于55冰箱中冰箱中3min3min，以使细，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。胞和悬浮培养基之间达到平衡。(1)(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；一较大的金属容器中；(2)(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)(3

11、)以以1-2/min1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点对温度之上几度的细胞冻结点(通常为通常为-30)-30)；(4)(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；时尽可能快地发生相变；2 2控速冷冻控速冷冻 (5)(5)细胞冻结后，将致冷速度降为细胞冻结后，将致冷速度降为1/min1/min，直，直到温度达到温度达-50-50；(6)(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)(-)96)或气相或气相(-156)(-156)中保存。中保

12、存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一瓶置于一7070冰箱中冷冻冰箱中冷冻4h4h，然后迅速移入，然后迅速移入液氮罐中保存。液氮罐中保存。1从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速将安瓿置于迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以水浴中，并轻轻摇动以加速解；加速解；3用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取数次，然后取0.1-0.2ml(约约4、8滴滴

13、)转接入琼脂转接入琼脂斜面上。斜面上。(三三)复苏复苏2.22.2 冻干保藏冻干保藏 n 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。n冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。n大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年

14、之年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。冷冻保藏，便于运输。培养物的冻干过程培养物的冻干过程1 1启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的温度达到温度达到-40-40时启动真空泵，使真空度达时启动真空泵，使真空度达到到2.672.674.00Pa4.00Pa。2 2将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入2 23 3体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温控仪降温探头打开降温探头控制醇浴温控仪降温探头打开降温探头控制醇浴温度在度在-40-

15、40，这，这过程约需过程约需30min30min。(二二)操作步骤操作步骤3 3每支斜面加入每支斜面加入2ml 202ml 20的脱脂乳，然后用的脱脂乳，然后用巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液，最终菌株浓度一般要求在菌体均悬液，最终菌株浓度一般要求在10106 6CFUCFUm1m1用细菌浸没培养物来保藏时，用细菌浸没培养物来保藏时，加入加入4040的脱脂乳，混合制成含的脱脂乳，混合制成含10106 6CFUCFUmlml的均悬液。的均悬液。4 4取下安瓿上的棉塞，然后用取下安瓿上的棉塞，然后用lmllml移液管分装移液管分装安瓿安瓿(0.

16、2ml(0.2ml瓿瓿)，重新塞好棉塞。，重新塞好棉塞。5 5轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮。将安轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮。将安瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节温控装置。使细胞悬液迅速冻结。温控装置。使细胞悬液迅速冻结。6 615min15min后，将歧管与真空泵相通。后，将歧管与真空泵相通。7 7维持维持-40-40的醇浴温度的醇浴温度90-120min90-120min，然后调节温，然后调节温控装置。使醇浴温度上升至控装置。使醇浴温度上升至-10-10，维持，维持2h2h。8 8关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上关掉可调温控装置的降温

17、探头，让醇浴温度上升至室温升至室温(25)(25)9 9在冷冻干燥的最初在冷冻干燥的最初4h4h内应定期测真空度，在安内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后瓿置于真空下后1h1h内，真空度必须达到内，真空度必须达到13.33Pa13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到并于菌悬液接近干燥时逐渐降到2.672.674.0Pa4.0Pa。10 10 在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机 中至少中至少16h16h以获得完全干燥。以获得完全干燥。1111干燥后，在干燥后，在2.672.674.00Pa4.00Pa的真空度下封瓶的真空度下封瓶1212在所有安瓿都封盖好

18、后，撤去真空。在所有安瓿都封盖好后，撤去真空。1313关闭真空泵。关闭真空泵。1414关闭冷凝器。关闭冷凝器。(三三)冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生1 1保藏：冷冻干燥后的培养物在低于保藏：冷冻干燥后的培养物在低于55下保藏。下保藏。较低的保藏温度较低的保藏温度(-20(-20-70)-70)对于培养物的长期对于培养物的长期稳定更好。稳定更好。2 2复苏：复苏：(1)(1)在超净工作台中用在超净工作台中用7070酒精棉球擦洗安瓿，然酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿

19、，然后用手掰开安瓿安瓿(3)(3)在安瓿中加入在安瓿中加入0.50.51ml1ml营养液体培养基，慢慢旋营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。涂布平板。(4)(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有接振落入盛有l l2ml2ml液体培养基的试管中，轻轻振液体培养基的试管中，轻轻振荡荡5 5l0minl0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。，然后用此悬液接种适宜

20、的再生培养基。2.3 2.3 其他保藏方法其他保藏方法一、传代保藏一、传代保藏二、矿物油中浸没保藏二、矿物油中浸没保藏 一、传代保藏一、传代保藏n将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。n可用于实验室中若干菌种的保藏。可用于实验室中若干菌种的保藏。n此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。n但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。变。n因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能因

21、此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。n斜面培养物应在密闭容器中于斜面培养物应在密闭容器中于55保藏，以防保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。止培养基脱水并能降低代谢活性。n此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。方法。二、矿物油中浸没保藏二、矿物油中浸没保藏n将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。温下保藏，此方法简便有效。n可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏

22、。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。更为有效。n浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经养基上生长，然后注入经170下灭菌下灭菌1-2h的矿物油，的矿物油，矿物油的用量以高出培养物矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。为宜。n以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还

23、十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株23年也应做年也应做一次存活试验。一次存活试验。不同菌种保藏方法比较不同菌种保藏方法比较2.42.4 基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏n由载体质粒等携带的外源由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。粒基因通常为宿主

24、细胞生长非必需。n一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。会加快。n当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。助维持质粒复制与染色体复制的协调。n我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。培养基中。2.5 2.5 微生物活力和稳定性测定微生物活

25、力和稳定性测定 n所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。保持菌种的优良性状不变。n在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。亡程度和遗传稳定性。建建 议！议！n对工业微生物生产菌种来说，建议保藏对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标产生、酶活力、遗传

26、特征及生化指标)应应在保藏后加以检测和确定。在保藏后加以检测和确定。n加速保藏试验可用于预测保藏过程中保加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。nn成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏在保藏6个月、个月、1年或更长时间后存活百分率年或更长时间后存活百分率(或存活单位或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。滴度的稳定性，后者极为重要。