Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项

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1、Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-1016:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine2000Lipofectamine2000是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。特点两个关键性特点使得Lipofectamine2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine2000试剂，无需

2、换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育2496小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用50口l无血清培养基（如OPTI-MEMI培养基）稀释0.8ug-1.0ugDNA。对于每孔细胞，使用50口lOPTI-MEMI培养基稀释1口1-3口lLIPOFECTAMINE2000试剂。Lipofe

3、ctamine2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。）注意：即使Lipofectamine2000使用OPTI-MEMI稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine2000（第3步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移

4、去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。在37C,5%的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H,293-F,C0S-7L和CHO细胞的试

5、验，同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。适用细胞株范围不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株，甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细胞株越多，当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen网站的资料，Lipofectamine2000已经证实可用于高达517种细胞株，覆盖了相当广的范围。要看看Lipofectamine2000是否适用于你现有的细胞株，可以访问以下Invitrogen网址(用量和价格好东西往往不便宜。可是

6、在实验室中，价格往往是最具有杀伤力的。Lipofectamine2000用的剂量大吗？价格如何？根据说明书，24孔板转染每次用2ul左右，1.5mlLipofectamine2000大约可做750次24孔板转染，或者大约150次6孔板转染，而1.5mlLipofectamine2000当前市场价格4667元，0.75ml价格是2798元(可以磨到多少折扣就要看你的侃价功力了)。平均下来，再算上折扣，Lipofectamine2000性价比还是挺高的。注意事项Lipofectamine2000要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofect

7、amine2000可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lipofectamine2000匹配，比如已知CD293,SFMII,VP-SFM就不行。此外还应该留意，如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用Lipofectamine2000。对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的

8、转染效率。DNA和转染试剂的比例，通常推荐是1:2或者1:3，优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GE

9、NETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。当然还有要注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌，Invitrogen自然是大力推荐自家的质粒纯化产品啦，这个嘛，看看生物通前面的质粒纯化专题有特别介绍就好啦。二、今年的新产品：Lipofectamine2000CD和Optifect作为一个新产品，Lipofectamine2000CD当然应该有区别于原来的Lipofectamine2000。这个1ml就要卖到5000多块的新

10、产品好在哪里？主要是由于不采用动物来源的材料，可以满足某些特殊要求，比如要求不含动物来源材料等。其他优缺点和Lipofectamine2000差不多。以24孔板计算，一次2ul,1ml足够500次转染，但价格不便宜，要5000多元。Optifeet主要是为在较低铺板密度条件下转染而设计的，比如细胞增埴相关基因和细胞周期相关基因的表达和研究往往要求较长的表达周期，细胞表面蛋白的表达和研究、还有部分高通量筛选等等也要求在较低铺板密度条件下转染，由于Lipofectamine2000要求转染时9095%汇片而不太适合，Optifeet就是一个选择。Optifect最佳的铺板密度是30%-70%，其他

11、的操作和注意事项也和Lipofectamine2000相近。同样可以直接加入细胞培养物中，转染前后都不需要更换血清，同样不要加抗生素，等等。lml价格是3616，用量相对高一些，24孔板一次需要34ul,6孔板就要用到1524ul/次，每次算下来就比前面的贵了。三、闻道有先后，术业有专攻，Invitrogen的其他几个当家花旦LIPOFECTAMINEPLUS：是老版LIPOFECTAMINE的改良版。加入PLUS试剂后会导致在广泛条件下的高活性，不需要进行细节优化就可以进行高活性转染了。实验步骤同样很简单，细胞铺板密度以转染当天汇合度至70%到90%为宜。DMRIE-C转染悬浮细胞效率最高，

12、如Jurkat细胞以及其他淋巴细胞来源的细胞系。也可以用来转染摇瓶中使用CDCHO培养基培养的悬浮CHO细胞，易于放大。另外建议用DMRIE-C将RNA转染入贴壁细胞。它比使用LIPOFECTIN转染RNA至BHK-21细胞的表达水平高。CELLFECTIN转染昆虫细胞的首选，特别是于昆虫基因表达中生产杆状病毒的Sf9和Sf21细胞以及果蝇细胞。LIPOFECTIN已经成功用于人类和非人类内皮细胞的瞬时转染。除了质粒DNA转染外，使用LIPOFECTIN也可以将RNA，寡聚核苷酸，酵母人工染色体和蛋白转入多种细胞系。四、阳离子转染试剂的一些注意事项（Invitrogen提供）有血清时的转染：血

13、清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMI培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE2000。培养基中的抗生素：抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了

14、细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。细胞维护和培养的演变：可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次，不要使细胞保持融合超过24小时。大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致

15、和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。细胞铺板密度：用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2X106-4X106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量

16、。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度最高的，CAT活性也最高，试剂的量也相应增加。这些结果说明，对于转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。启动子的选择：获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子，如SV40和RSV相比，在BHK-21中其活性最高。这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。SV40

17、启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。DNA量：咼质量的DNA对于进彳丁咼效的转染至关重要。瞬时和稳定表达：DNA转染后，转入基因的表达可以在14天内检测到。仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。瞬时表达分析检测非重组质粒DNA上基因的表达。因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必

18、须很小心。为了进行稳定表达，转入的基因必须能和细胞同步复制。在转染的质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此。在一小部分转染的细胞中，加入的DNA通过重组整合到基因组上。包含整合DNA的细胞很少，必须通过对药物的抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定。稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需的时间更长。但得到的细胞系可以做为蛋白生产的稳定来源或用于得到转基因动物。瞬时转染和转染效率的监测：基因的瞬时表达在24-72小时内就结束了。这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。常用的报告基

19、因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT），绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）。可以使用简单的非同位素方法检测b-gal的表达以测定转染效率和活性。pCMV-SPORT-bgal质粒包含CMV启动子调控下的LacZ基因，转染入真核细胞内后可以直接表达bgal。结合简单的检测步骤，可以做为监测转染条件的一种方便灵敏的方法。稳定转染细胞系的筛选：连同带有药物抗性的筛选标记基因一起转染目的基因是建立稳定转染细胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸转移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对GENETCIN选择性抗生素（G418Sulf

20、ate）的抗性。抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质粒上，也可以在不同的质粒上。如果两个不同的质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子。对于两种不同质粒的共转染，带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为3:1或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。瞬时转染效率的改进一般也会提高稳定转染效率。比如，使用LIPOFECTAMINEPLUS试剂得到的NIH3T3细胞GENETICIN抗生素抗性克隆的数目比单独使用LIPOFECTAMINE增加了大约3倍。要进行稳定的表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力。生长的细胞比不分裂的细胞更快的受到G

21、ENETICIN抗生素的影响。转染后，在开始筛选前等待48-72小时，使细胞表达足够量的抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护。转染后48-72小时倒掉培养基，加入含有GENETICIN抗生素的培养基，抗生素的浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞。因为许多因子影响到筛选所需的GENETICIN抗生素的最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度。筛选可能需要较长时间，因为在致死剂量的GENETICIN抗生素存在条件下，细胞会分裂1-2次。在维持培养细胞时使用较低剂量的抗生素，一般是筛选剂量的一半。筛选后的细胞一般是离散的克隆，根据实验目

22、的不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆的计数。蛋白表达和培养基的选择：哺乳动物细胞系合成可溶的，翻译后修饰的蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有可能有生物活性。稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白。常用的细胞系包括CHO,293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F,293-H,COS-7和CHO-S细胞，来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基。重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白。使用基质珠做为固相支

23、持可以使贴壁细胞悬浮生长。用于蛋白生产的细胞的转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行。但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白,因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培养基低得多）。无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化学成分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。多种多样的配方使您可以选择最适合您应用的一种。在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基,无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。在部分情况下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），对于已适应无血清

24、或无蛋白培养基的细胞,可以使用其培养基进行转染。其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染的成分。在这些情况下，有必要在诸如D-MEM或OPTI-MEMI等培养基中进行培养和转染.转染FAQs：针对同种阳离子脂质体的疑难解答Q1：转染效率低A1:1）没有使用优化的阳离子脂质体试剂。解决建议:选择针对您的细胞类型转染效率可能最高的阳离子脂质体试剂。参见附录A或网站（上“TransfectionCollection中的参考文献列表。2）没有使用优化条件。解决建议：优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。参见第7章优化步骤。参见网站（在Tech-online分子生物学部分）上的细胞特异性的转染步骤。

25、3）DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。解决建议：在复合体形成时不要使用血清。OPTI-MEMI培养基和DMEM是用于复合体形成的较好的培养基。如果使用含有血清的培养基进行转染，保证在无血清条件形成复合物。注意：不要将OPTI-MEMI培养基用于LIPOFECTAMINEPLUS试剂或昆虫细胞。对于Sf9和Sf21细胞，Sf-900IISFM会得到最佳结果。4）存在抑制剂。解决建议：不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。5）不恰当的细胞密度。解决建议:细胞密度应该在

26、转染时融合度为70%-90%。6）转染DNA的启动子-增强子没有被宿主细胞识别。解决建议：确保转染DNA的启动子-增强子同目的细胞类型兼容。7）阳离子脂质体试剂冻结。解决建议:不要使用冻结的或储存温度低于4C的阳离子脂质体试剂。8）转染分析的问题。解决建议:转染分析中加入阳性对照。9）质粒纯化的问题。解决建议:请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用DEAE树脂而非硅树脂，并且最好是用重力流动（过滤）的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法（可用于任何级别的纯化试剂盒），是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于55C的水浴上保温5分

27、钟。最后小心地从上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。Q2:细胞死亡率高。A2:1）DNA量太高。解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定最佳的DNA量。在剂量-反应转染中加入阳离子脂质体试剂，因为单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调优化方法。2）阳离子脂质体试剂量太高。解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。在剂量-反应转染中加入DNA，因为单独阳离子脂质体试剂也只对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调优化方法。3）在转染过程中使用抗菌素。解决建议:在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂

28、使细胞更敏感。4）细胞太少。解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定每个转染过程中最佳的细胞数量。根据您的应用所要求的效率调整细胞数量。5）在无血清条件下细胞活性降低。解决建议:使用OPTI-MEMI培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。在转染培养基中使用5%到10%的血清。确保在不存在血清的条件下形成复合物。6）阳离子脂质体试剂氧化了。解决建议:不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。7）对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。解决建议:在加入筛选性抗生素前至少预留48小时使细胞表达抗性基因。Q3:阳离子脂质体试剂-DNA复合物沉淀。注意：在显微静下可以在

29、细胞上观察到小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此沉淀是否存在并不表明转染效率的高低。A3:1）存在过剩的EDTA。解决建议:使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用浓度0.3mM的EDTA溶液稀释DNA。2）DNA或阳离子脂质体试剂浓度过高。解决建议：确保阳离子脂质体试剂和DNA的浓度不要超过复合物形成的建议量（参见表5）。Q4:转染重复性不好。A4:1）转染时的融合度波动。解决建议:在不同的转染时报持所有的转染参数恒定，如融合度，传代次数和生长时相等。2）在培养中细胞发生变化。解决建议:如果可能，使用来源于经选择转染效率较高亚系的细胞。如果可能，融化新鲜细胞。针对不同阳离子脂质体的疑难解答CEL

30、LFECTIN试剂或DMRIE-C试剂Q：试剂溶液混浊。A:这是正常的。确保在转染吸取液体前混合试剂（颠倒5到10次）。LIPOFECTIN试剂Q1：未稀释的试剂即混浊。A1:不要使用。可能已冰冻或在低于4C保存。Q2:试剂稀释后混浊。A2:这是正常的。未稀释的LIPOFECTIN试剂是澄清的。当稀释于OPTI-MEMI时会变混浊。Q3:转染效率低。A3:在加入DNA前将LIPOFECTIN试剂在OPTI-MEM1（或其他无血清培养基）中温育30分钟。LIPOFECTAMINE试剂Q：荧光背景。A:在免疫细胞化学转染后会检测到荧光背景。LIPOFECTAMINE试剂本身没有荧光。LIPOFEC

31、TAMINEPLUSQ1:转染效率低A1:1）试剂的加入顺序不对。将DNA和PLUS试剂在稀释培养基中混合，然后将混合液同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合。2）:在复合前稀释的DNA或PLUS没有充分混合。确保在混合前每孔都混合好。在进行预复合的稀释培养基中加入DNA和PLUS试剂的顺序不影响转染活性。3）没有使用LIPOFECTAMINE试剂。确保在加入到细胞前将DNA-PLUS试剂复合物同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合并温育。LIPOFECTAMINE2000Q1:转染效率低。A1:1）对于在OPTI-MEMI中制备的稀释液，确保稀释的LIPOFECTAMINE2000在30分钟内同稀释的DNA混合。2）如果使用D-MEM做为稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合3）细胞密度对于转染太低。在转染时细胞融合度应为90%。Q2:复合物溶液混浊。A2:这是正常的。