化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型课件

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1、41.化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。2.化学发光免疫分析的基本原理及其技术类化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型。型。3.化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技术。术。4.电化学发光免疫分析基本原理。电化学发光免疫分析基本原理。5.化学发光免疫技术的临床应用。化学发光免疫技术的临床应用。本章要点本章要点返回总目录返回总目录目录目录 基本知识基本知识1化学发光免疫分析化学发光免疫分析2化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析3电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析4化学发光免疫技术的临床应用化学发光免疫技术的临床应用5返回总

2、目录返回总目录 化学发光免疫化学发光免疫技术技术是将具有高灵敏度的化学发光是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的测定技术与高特异性的抗原抗体抗原抗体反应相结合，用反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术、维生素和药物等的检测分析技术。该技术具有。该技术具有特异性高、特异性高、灵敏度灵敏度高、分离简便、高、分离简便、快速、试剂无快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化毒、安全稳定、可自动化分析等特点，在免疫学分析等特点，在免疫学检验中应用广泛。检验中应用广泛。前前 言言放放射射免免疫疫技技术术酶酶免免疫疫技

3、技术术荧荧光光免免疫疫技技术术金金免免疫疫技技术术化化学学发发光光免免疫疫技技术术标记免疫技术标记免疫技术第一节第一节 基本知识基本知识 一、发光一、发光发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态，的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态，释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激发能不同可将发光分为发能不同可将发光分为光照发光光照发光、生物发光生物发光和和化学发化学发光光。1.光照发光（photoluminescence）发光剂（荧光素）经短波长

4、入射光照射后发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。波长的可见光。2.生物发光（bioluminescence）发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATPATP产产能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。的能量以光子的形式释放出来。3.化学发光某些物质某些物质(发光剂发光剂)在化学反应时，吸收了反

5、应在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。式释放出能量，这一现象称为化学发光。一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：该反应必须提供足够的激发能该反应必须提供足够的激发能,并由某一步骤单并由某一步骤单独提供独提供,因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在

6、溶液中而不能发光消失在溶液中而不能发光要有有利的反应过程要有有利的反应过程,使化学反应的能量至少能被使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态一种物质所接受并生成激发态激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子出光子,或者能够转移它的能量给另一个分子使之进或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子入激发态并释放出光子 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为式释放能量的化合物称为化学发光剂化学发光剂或或发光底物发光底物。二二.化学发光剂化学发

7、光剂作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下几个条作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下几个条件：件：发光的量子产率高发光的量子产率高 物理物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性 常用的化学发光剂或发光底物有常用的化学发光剂或发光底物有 1.1.直接化学发光剂直接化学发光剂 2.2.酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 3.3.电化学发光剂电化学发光

8、剂 1.直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。如常用的吖啶酯（如常用的吖啶酯（acridiniumacridinium，AEAE）。吖啶酯吖啶酯在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化时氧化时,发出波长发出波长为为470nm470nm的光，具有很高的发光效率，其激发的光，具有很高的发光效率，其激发态产物态产物N-N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。甲基吖啶酮是该发光反应

9、体系的发光体。2.酶促反应的发光底物 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧 化物酶（化物酶（HRPHRP）和碱性磷酸酶（）和碱性磷酸酶（ALPALP）。）。HRPHRP的常用的常用 的发光底物为鲁米诺或其衍生物，的发光底物为鲁米诺或其衍生物，ALPALP的发光底物的发光底物 为金刚烷（为金刚烷（AMPPDAMPPD）（1）鲁米诺或其衍生物 鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长

10、为学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm425nm的光。的光。鲁米诺增强发光反应原理鲁米诺增强发光反应原理（2）AMPPD 3-(23-(2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基)苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷3电化学发光剂 电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+和和电子供体三丙胺（电子供体三丙胺（TPATPA）在阳性电极表面可同时失去）在阳性电极表面可同时失去一

11、个电子而发生氧化反应。一个电子而发生氧化反应。用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原抗原)，与，与待测标本中相应的抗原待测标本中相应的抗原(抗体抗体)和磁颗粒性的抗体和磁颗粒性的抗体（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状态（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，这时只需加入氧化剂（开来，这时只需加入氧化剂（H2O2H2O2）和）和NaOHNaOH使成碱使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和

12、光电倍增管接收、记录单位时间内光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原所产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原(抗体抗体)的含量的含量 第二节第二节 化学发光免疫分析化学发光免疫分析一、一、检测原理检测原理化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或，与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后抗原通过一定模式的免疫学反应后,

13、最终通过在磁场最终通过在磁场中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物进行分离的技术。进行分离的技术。二、方法类型二、方法类型 2.2.常用的免疫学反应模式常用的免疫学反应模式 双抗原夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法固相抗原竞争法双抗体夹心法双抗体夹心法三、技术要点三、技术要点抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离结合物与游离物的分离(磁颗粒分离技术磁颗粒分离技术)化学发光反应化学发光反应 化学发光酶免疫分析（化学发光酶免疫分析（CLEIACLEIA）是用参与催化某一化学）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（发光反

14、应的酶如辣根过氧化物酶（HRPHRP）或碱性磷酸）或碱性磷酸酶酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗体抗体(抗原抗原)发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离的酶标物分离后，加入底物的酶标物分离后，加入底物(发光剂发光剂)，酶催化和分解，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。机数据处理系统，计算出测定物的浓度。

15、第三节第三节 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析一、一、检测原理检测原理碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图 1.1.根据标记酶不同分类根据标记酶不同分类 可分为辣根过氧化物可分为辣根过氧化物酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标记的化学发光酶免疫分析。前者常以酶标记的化学发光酶免疫分析。前者常以鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常以以AMPPDAMPPD作为发光底物。作为发光底物。2.2.根据免疫学反应模式分类根据免疫学反应模式分类 同化学发光同化学发光

16、免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而不是直接标记发光剂。不是直接标记发光剂。二、方法类型二、方法类型 三、技术要点三、技术要点抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离结合物与游离物的分离（磁颗粒分离法磁颗粒分离法 、微粒子捕获法、微粒子捕获法 、包被聚苯乙烯反应孔分离法、包被聚苯乙烯反应孔分离法 ）酶促发光反应酶促发光反应 电化学发光免疫分析（电化学发光免疫分析（ECLIAECLIA）是以电化学发光剂三

17、联）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体吡啶钌标记抗体(抗原抗原)，通过抗原抗体反应和磁珠分，通过抗原抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定量分析，它包括电化学和化学测的抗原或抗体进行定量分析，它包括电化学和化学发光两个过程。发光两个过程。第四节第四节 电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析一、一、检测原理检测原理电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术2.2

18、.免疫学反应模式免疫学反应模式 其反应模式同发光免疫分其反应模式同发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不同只是固相抗原竞争法三种主要模式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌。相应抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌。二、方法类型二、方法类型 三、技术要点三、技术要点抗原抗体反应抗原抗体反应 结合物与游离物的分离结合物与游离物的分离(磁颗粒分离技术磁颗粒分离技术)电化学发光过程电化学发光过程 第五节第五节 化学发光免疫技术的临床应用化学发光免疫技术的临床应用一、化学发光免疫技术的特点一、化学发光免疫技术的特点1.

19、1.敏感度高，甚至超过敏感度高，甚至超过RIARIA；2.2.精密度和准确性均可与精密度和准确性均可与RIARIA相比；相比；3.3.试剂稳定，无毒害；试剂稳定，无毒害；4.4.测定耗时短；测定耗时短；5.5.测定项目多；测定项目多；6.6.已发展成自动化测定系统。已发展成自动化测定系统。1.1.甲状腺激素甲状腺激素 T3T3、T4T4、hTSHhTSH、FT4FT4、FT3FT3。、。、抗抗TPOTPO、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。2.2.生殖激素生殖激素 -HCG-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黄、催乳素、促卵泡激素、促黄体激素、孕酮、雌二醇、

20、非结合雌三醇、甲胎蛋白体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋白、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。3.3.肾上腺肾上腺/垂体激素垂体激素 皮质醇、尿皮质醇、人生长激皮质醇、尿皮质醇、人生长激素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目4.4.贫血因子贫血因子 维生素维生素B12B12、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋白、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋白等。等。5.5.肿瘤标记物肿瘤标记物 AFPAFP、CEACEA、PSAPSA、游离、游离PSAPSA、CAl9-9CAl9-9、CAl25CAl25、

21、CAl5-3CAl5-3等。等。6 6感染性疾病感染性疾病 衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原体抗原确认、弓形体体抗原确认、弓形体IgGIgG抗体、弓形体抗体、弓形体IgMIgM抗体、风抗体、风疹病毒疹病毒IgGIgG抗体、风疹病毒抗体、风疹病毒IgMIgM抗体、巨细胞病毒抗体、巨细胞病毒IgGIgG抗抗体、巨细胞病毒体、巨细胞病毒IgMIgM抗体等。抗体等。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目7 7糖尿病糖尿病 胰岛素、胰岛素、C C肽等。肽等。8 8心血管系统心血管系统 肌酸激酶肌酸激酶MBMB同工酶、地高辛、肌红同工酶、地高辛、肌

22、红蛋白、肌钙蛋白蛋白、肌钙蛋白-1-1等。等。9 9病毒标记物病毒标记物 HIVl/2AbHIVl/2Ab、HbsAgHbsAg、HBsAgHBsAg确认、确认、HbsAbHbsAb、HCVAbHCVAb、HAV IgMHAV IgM、HAVAbHAVAb、HbcAbHbcAb、HBclgMHBclgM、HBeAgHBeAg、HBeAbHBeAb等。等。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目1010骨代谢骨代谢 骨胶原酶、脱氧吡啶啉等。骨胶原酶、脱氧吡啶啉等。1111过敏性疾病过敏性疾病 总总IgEIgE、特异性、特异性IgEIgE等。等。1212治疗药物监测治疗药物监测 茶碱、地高辛、环孢素、茶碱、地高辛、环孢素、巴比妥等。巴比妥等。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。分析和电化学发光免疫分析。小小 结结谢谢 谢！谢！