RNA的生物合成 转录.ppt

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1、第 十 一 章 RNA的生物合成 RNA Biosynthesis 转录 (transcription)： 以 DNA为模板指导合 成 RNA的过程 。 是 RNA合成的主要方式 。 RNA复制 (RNA replication):以 RNA为模板指 导合成 RNA的过程 。 主要见于除逆转录病 毒以外的 RNA病毒 。 RNA生物合成有两种方式 转录 (transcription) 生物体以 DNA为模板指导合成 RNA的过程 。 转 录 RNA DNA mRNA(messenger RNA) 把遗传信息从 DNA中转录出来 ， 作为蛋 白质合成的直接模板 。 tRNA(transfer R

2、NA ) 各种氨基酸的载体并以其反密码子识 别 mRNA上的密码子 。 rRNA（ ribosomal RNA） 与蛋白质共同构成核糖体 ， 做为蛋白 质合成场所 。 转录主要产物 参与转录的物质 原料 : NTP (ATP, GTP, CTP ,UTP) 模板 : 基因区的 DNA单链 酶 : DNA依赖的 RNA聚合酶 (DNA-dependent RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子 一、 转录模板 RNA 的转录为 不对称转录 (asymmetric transcription)， 有两方面含义： 在 DNA双链分子上 ， 对于某基因 ， 一股 链可转录 （

3、 模板链 ） ， 另一股链不转录 （ 编码链 ） 。 模板链并非永远在同一单链上 。 第一节 原核生物转录的模板和酶 5 3 3 5 模板链 编码链 编码链 模板链 结构基因 转录方向 转录方向 转录中 RNA生成的 方向是 5 3方向延长， 模板链为 35 方向 。 模板链 (template strand) 按照碱基配对原则指导转录生成 RNA的 DNA单链 。 又称 有意义链 、 Watson链 。 编码链 （ coding strand) 模板链的互补链 。 又称 反意义链 、 Crick链 。 其碱基序列与 mRNA一致 ， 若以 U代替 T。 文 献中刊出的基因序列为编码链 。 5

4、GCAGTACATGTC 3 3 c g t g a t g t a c a g 5 5GCAGUACAUGUC 3 NAla Val His Val C 编码链 模板链 mRNA 蛋白质 转录 翻译 亚基（因子） 核心酶 2 全酶 2 大肠杆菌 (E.coli)的 RNA聚合酶： 二、原核生物的 RNA聚合酶 核心酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme) 亚基 ：功能是辨认转录起始点 。 2 称核心酶 (core enzyme)：催 化 NTP按模板的指引合成 RNA。 转录延 长阶段仅需核心酶 。 全酶 (holoenzyme)：转录起始时需全 酶 。 启动子（启动序

5、列） 操纵序列 结构基因（几个） 操纵 子 其他调节序列 调控序列 原核生物基因转录模式： 操纵子模式 三、模板与酶的辨认结合 操纵子：每一转录区段可视为一个转录 单位，称为操纵子。 结构基因 （编码序列） 启动子 操纵序列 其他调节序列 (promoter) (operator) 原核生物操纵子 （ operon） 启动子 (promoter)是转录起始时 RNA聚合 酶结合模板 DNA的部位。 原核生物启动子（ RNA聚合酶 保护区） 约 40 60bp大小 。 以结构基因第一个碱基 为 1， 以负数表示基因上游 ， 在启动子 的 35区和 10区存在保守序列或一致性 序列 。 35区 的

6、一致性序列是 TTGACA， 是转录 起始的辨认位点 ， 由 因子辨认结合 。 10区 是 TATAAT， 也称 Pribnow盒 ， 与 RNA pol有较牢固的结合 。 开始转录 T T G A C A A A C T G T -35 区 (Pribnow box) T A T A A T Pu A T A T T A Py -10 区 1 -30 -50 10 -10 -40 -20 5 3 3 5 原核生物启动子保守序列 RNA-pol辨认位点 5 5 RNA聚合酶保护区 结构基因 3 3 原核生物启动子结构 RNA转录起始 -35区 -10区 TTGACA TTAACT TTTACA

7、 TATGAT TTTACA TATGTT TTGATA TATAAT CTGACG TACTGT N17 N16 N17 N16 N16 N7 N7 N6 N7 N6 A A A A A trp tRNAtrp lac recA Ara TTGACA TATAAT 共有序列 X/45 38 36 29 37 37 28 40 25 30 41 29 44 转录过程 转录起始 转录延长 转录终止 第二节 原核生物的转录过程 1.因子辨认转录起始点 ,全酶与之结合 。 因 子 辨 认 结 合 启 动 子 35 区的 TTGACA序列 。 2.全酶随即移向 10区的 TATAAT序列并 跨入转录起

8、始区 。 一、转录起始 3.解开局部双链 ， 在 RNA-pol催化下 ， 生成 RNA第一个 3,5磷酸二酯键 ， 形成 转录起始 复合物 。 RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3 转录生成的 RNA的第一位 ， 即 5端总是 GTP 或 ATP， 以 GTP更为常见 。 4.因子即从转录复合物上脱落 ， 转录起始结 束 。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi 二、转录延长 1.因子脱落后 ， 在 核心酶 作用下 ， 以 NTP为底物 ， 按照碱基配对原则 （ 与 DNA单链模板： C-G, A-U, T-A)， 逐个生成 3,5 磷酸二酯键 ， 延长 R

9、NA链 。 2.酶是沿着模板链的 3 5方向 ， 转 录产物是从 5 3延长 。 3.转录空泡 (transcription bubble)亦 称转录复合物 ， 包括：核心酶 、 DNA模板和转录产物 。 4.在 DNA模板上多个转录同时进行 ， 转录的 mRNA上多聚核糖体翻译 。 转录空泡 (transcription bubble)： RNA-pol （ 核心酶 ） DNA RNA 5 3 DNA 原核生物转录过程中的羽毛状现象 核糖体 RNA RNA聚合酶 三、 转录终止 有依赖 因子（ Rho）与非依赖 因子转 录终止两类 1.依赖 因子的转录终止 因子 由相同的 6个亚基组成的六聚

10、体 蛋白质。 因子可与 RNA 3端 polyC结合 ，有 ATP酶活性和解螺旋酶的活性。 作用机制： RNA转录接近终点时， 3末端出现 polyC ， 因子与 polyC结合， 因子和 RNA聚合酶发生构象变化， RNA聚合 酶停顿。 因子 ATP酶活性和解螺旋酶的活性 使 DNA:RNA杂化双链拆离， RNA从 转录复合物中释放。 A T P 依赖 因子的转录终止 2、非依赖 因子的转录终止 结构： 接近终止转录区， RNA转录产物 3-末端有若干个连续的 U,在此之前的部 分碱基可形成鼓槌状的 茎环结构 (stem- loop)或发夹结构 (hairpin)。 5UUGCAGCCUGA

11、CAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 AGCCUUUUU 3 RNA UUUU. UUUU. CCUUUUU GC . 茎环 (stem-loop)/发夹 (hairpin)结构 机理： 茎环结构在 RNA末端形成 ， 改变 RNA聚合酶的构象 ， 使转录停顿 。 通过茎环结构与 RNA聚合酶及 DNA的 相互作用 ， 使 RNA解离出来 ， 转录终 止 。 茎环结构使转录终止的机理 5pppG 5 3 3 5 RNA-pol 一、真核生物的 RNA聚合酶 RNA-pol RNA-pol RNA-pol RNA 聚合酶 真核生物 RN

12、A聚合酶比原核生物复杂，其 都有两个不同的大亚基和十几个小亚基。 第三节 真核生物 RNA的生物合成 真核生物 RNA聚合酶特性与催化产物 种类 转录产物 45S-rRNA hnRNA 5S-rRNA, tRNA, snRNA 加工产物 18S-rRNA 28S-rRNA 5.8S-rRNA mRNA 同上 鹅膏蕈碱 反应 耐受 极敏感 中度敏感 hnRNA(杂化核 RNA， hetero-nuclear RNA)： 经加工生成 mRNA snRNA(核内小 RNA, small nuclear RNA) ： 有多种 ， 由 100-300核苷酸组成 ， 参与 RNA的剪接过程 。 启动子 增

13、强子 沉默子 TATA盒（ Hogness盒） CAAT盒 GC盒 顺式作用元件 二、真核生物转录起始 真核生物转录模式： 顺式作用元件 +结构基因 转录起始点 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子或 沉默子 真核生物转录模式 AATAAA 切离加尾 转录终止点 修饰点 外显子 翻译起始点 内 含 子 （一）顺式作用元件 （ Cis-acting element） 概念： 是指可影响自身基因表达活性 的 DNA序列 。 可位于结构基因两侧 ， 多见于上游 ， 包括 启动子 、 增强子和沉 默子 。 5 3 调控序列 TATA盒 Inr YYAN YY T A -30 +1 TATAAA 启动

14、子： 保守序列常见有 : TATA盒 （ Hogness盒 ， TATAAAA） CAAT盒 (GCCAAT) GC盒 (GGGCGG) 某些启动子具有位于转录起始点附近 的保守序列 ， 称为 起始子 (initiator, Inr) 。 启动子保守序列 可结合不同的转录因 子 ， 参与转录起始 。 TATA盒常是启动 子的核心序列 ， 可结合 TBP(TATA binding protein， TATA结合蛋白 )。 转录起始时 ， 多种转录因子结合于启 动子 ， 真核 RNA-pol通过转录因子间接 与启动子结合 ， 与原核 RNA-pol不同 。 增强子 (enhancer)： 是远离转

15、录起始点 ， 具有增强启动子转录活性的 DNA序列 。 其 可与 增强子结合蛋白 EBP(enhance binding protein)结合 ， 促进转录 。 沉默子 (silencer)： 是远离转录起始点 ， 可抑制基因转录的 DNA序列 。 其可与 转录 抑制因子 （ transcription inhibitor） 结合 ， 抑制转录 。 （二）转录因子 (transcriptional factor) 反式作用因子 (trans-acting factor) 某一基因表达的蛋白质间接或直接 作用于另一基因的顺式作用元件 ， 此类蛋白质称为反式作用因子 。 （二）转录因子 (tran

16、scriptional factor) 转录因子 (transcriptional factors, TF) 反式作用因子中，直接或间接结合 RNA聚合酶者称为转录因子。 转录因子 基本转录因子 转录激活因子 特异转录因子 转录抑制因子 TFIID由两类亚基组成 TBP(TATA binding protein， TATA结合蛋白 ) TAF(TBP associated factors， TBP辅助因子 ) 基本转录因子 是 RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋 白质因子 ， 决定 RNA的类别 。 相应于 RNA-pol 、 、 ， 分别称为 TFI、 TFII、 TFIII。 TFII又

17、分为 TFIIA、 TFIIB、 TFIID、 TFIIE、 TFIIF、 TFIIH等 。 参与 RNA-pol 转录的 TF 蛋白激酶活性，使 CTD 磷 酸化 TF H ATP ase57 （ ） 34 （ ）TF E 解螺旋酶30 ， 74TF F 促进 RNA - pol 结合及作 为其他因子结合的桥梁 33TF B 稳定 TF D - DNA 复合物12 ， 19 ， 35TF A 辅助 TBP - DNA 结合TAF * 结合 TATA 盒TBP * 3 8TF D 功 能亚基组成，分子量 ( kD )转录因子 蛋白激酶活性，使 磷 酸化 （ ） （ ） 解螺旋酶， 促进 结合及

18、作 为其他因子结合的桥梁 稳定 复合物， ， 辅助 结合 结合 盒 功 能 (三 )转录起始前复合物 真核生物转录起始首先形成 转录起始前 复合物 （ pre-initiation complex, PIC） 。 TFII-D通过 TBP结合 TATA盒为核心，其 他 TFII逐步加入，与 RNA-pol 、 启动 子共同形成 PIC。 pol TF H TF E TF F TAF TAF TF A TF B TBP DNA TATA 转录起始前复合物 （ pre-initiation complex, PIC） （四）转录起始复合物 转录起始前复合物 PIC形成后 ， 在迂 回折叠 DNA构

19、象中 ， 增强子结合蛋白 EBP（ enhance binding protein） 结合增强 子 ,同时与 TF D中的 TAF结合 ， 最后形 成 转录起始复合物 ， 启动转录 。 pol TF H TF E TF F TAF TAF TF A TF B TBP DNA TATA EBP 真核生物转录起始复合物 三、转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致 相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻 译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位 和解聚现象。 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol 核小体 转 录 延 长 中 的 核 小 体

20、移 位 转录方向 四、转录终止 基因读码框架下游 ， 常有共同序列 AATAAA（ 编码链 ） ， 再下游有多个 GT 序列 ， 两者之间为转录终止的 修饰点 。 转录越过修饰点 ， mRNA在修饰点处被 切断 ， 随即加入 polyA尾 及 5-帽子结构 。 RNA酶将余下的 RNA降解 ， 解螺旋酶和 释放酶帮助终止转录 。 核酸酶 RNA-pol AATAAA GTGTGTG 转录终止的修饰点 5 5 3 3 3切断并加尾 AAAAAAA 3 mRNA 转录中 mRNA 解螺旋酶和释放酶 转录终止过程 原核生物转录生成的 RNA一般不 需加工即可使用 ， 真核生物转录生成 的 RNA必须

21、经加工后才能使用 。 第四节 真核生物 RNA加工 真核生物结构基因转录初产物为 hnRNA， 需加工才能成为成熟的 mRNA。 5-端形成帽子结构 3-端加 polyA尾巴 内部剪接 mRNA的编辑 一、真核生物 mRNA转录后加工 （一） 5端形成帽子结构 形成过程 ：转录生成的 hnRNA经 与 GTP反 应 ， 生成三磷酸双鸟苷 (GpppG-)， 再将第 1或第 2个 G碱基 7位 N甲基化 ， 形成帽子结 构 (7-甲基鸟嘌呤三磷酸核苷 ,mGpppG- 或 GpppmG-)。 帽子结构功能 ：使 mRNA免遭核酸酶的攻 击；与翻译起始有关 。 5 pppGp 5 GpppGp p

22、ppG ppi 鸟苷酸 转移酶 5 mGpppGp 甲基化酶 SAM 帽 子 结 构 的 生 成 5 ppGp 磷酸酶 Pi （ 5 GpppmGp ） 帽子结构 5 mGpppGp （二） 3端加 polyA尾巴 形成过程： 转录越过修饰点后 ， mRNA 在修饰点处被切断 ， 加入 polyA尾巴 。 此 过程有多种因子和酶参加 。 功能： 维持 mRNA 作为翻译模板的活性 以及增加 mRNA 本身稳定性 。 1. hnRNA和断裂基因 hnRNA： 结构基因的初级转录产物 ， 加工 修饰后形成 mRNA。 hnRNA较成熟 mRNA大 几倍甚至数十倍 。 断裂基因 (split gen

23、e) ： 真核结构基因 ， 由 若干个编码区 （ 外显子 ） 和非编码区 （ 内 含子 ） 互相间隔但又连续而成 ， 转录后去 除内含子再连接 ， 故称断裂基因 。 (三 ) 内部剪接 2、外显子和内含子 外显子 (exon):在断裂基因及其初级转 录产物上出现 ， 并表达为成熟 RNA的核 酸序列 （ 编码区 ） 。 内含子 (intron) ： 隔断基因线形表达而 在剪接过程中被除去的核酸序列 （ 非编 码区 ） 。 鸡卵清蛋白 断裂基因 hnRNA 首、尾修饰 hnRNA剪接 成熟的 mRNA 3、 mRNA的剪接（ splicing) snRNA： 分子中 U碱基最丰富 ， 故以 U分

24、 类命名 ， 有 5种： U1、 U2、 U4、 U5、 U6。 snRNP： 5种 snRNA和蛋白质组成 5种 小分 子核糖核蛋白 snRNP， 参与 mRNA剪接 。 剪接： 去除初级转录产物中的内含子 ， 把 外显子连接为成熟的 RNA。 采用套索剪接 ， 发生在 核内 。 剪接体： mRNA的剪接在剪接体上进行 。 剪接体由 5种 snRNP（ U1 U6 snRNP） 组成 。 剪接体形成： 大多数内含子结构为 5- GU AG-3。 首先是 U1 、 U2 snRNP的 U1 、 U2 与内含子边界序列结合 ， U4 、 U5 、 U6 snRNP加入 ， 形成剪接体 。 snR

25、NP的 U1 、 U2 snRNA与内含子结合 UACUACA - AG UG U4 U5 U6 E1 E2 U1 U2 剪接体的 形成 剪接体催化中心： 剪接体释放 U1 、 U4 、 U5 后 ， U2 和 U6 形成 剪接体催 化中心 。 此时 ， 内含子弯曲成套索 状 ， 上下游外显子靠近 。 UACUACA - AG UG U6 E1 E2 U1、 U4、 U5 UACUACA - AG UG U4 U5 U6 E1 E2 U1 U2 催化中心的形成 U2 剪接过程： 在剪接体催化中心 ， 发生两次 转酯反应 。 第一次转酯反应 ：含鸟苷酸 pG、 ppG或 pppG的辅酶 ， 以

26、3-OH对 E1/I之间的磷酸二酯 键作亲电子攻击 ， 使共价键断开 。 第二次转酯反应 ： 由 E1的 3-OH对 I/E2之间 的磷酸二酯键作亲电子攻击 ， 使其断开 ， 2 个外显子相连而内含子被切除 。 pG-OH (ppG-OH, pppG-OH) GU-OH AGpU pGpA 第一次转酯反应 第二次转酯反应 GUpA AGpU 外显子 1 内含子 外显子 2 AG-OH GUpU pGpA mRNA的剪切 （ cleavage) 是 mRNA前体剪去 某些内含子 ， 在上游的外显子 3-端直接 加 polyA。 剪切是某些 mRNA的加工方式 。 剪切和剪接 两种加工方式有时共用

27、于某些 mRNA的转录后加工 。 （ 参见书图 11-23/24） 4、 mRNA的剪切（ cleavage) 肠粘膜细胞有特异的胞嘧啶核苷脱氨酶 ， 可与 apoB基因转录的 mRNA上第 2153密码子 CAA结合 ,将其 C转变为 U,使 CAA变为终止密码子 UAA,终止翻译 。 （四） mRNA的编辑 (mRNA editing) 人类 apo B基因 mRNA（ 14500个核苷酸 ） 肝脏 apo B100 （ 分子量为 513 kD） 肠道 apo B48 （ 分子量为 250kD） mRNA编辑 二、 rRNA的转录后加工 1. rRNA 基因结构 真核细胞的 rRNA基因属

28、于一种丰富基因 族的基因 ， 在染色体上出现多个串联的基 因 。 2. 加工过程 rRNA基因转录生成 45S-rRNA前体 ， 其中 包含有内含子 ， 经剪接后形成 18S、 5.8S及 28S rRNA。 rRNA的转录后加工 转录 45S - rRNA 剪接 18S - rRNA 5.8S和 28S-rRNA rDNA 内含子 内含子 28S 5.8S 18S 三、 tRNA的转录后加工 tRNA转录后加工包括： 5端前导序列切除 。 3端少量碱基序列切除 。 中部内含子切除 。 3端加 CCA-OH。 稀有碱基 形成 。 tRNA的转录 tRNA初产物 RNA pol DNA RNAa

29、seP 链接酶 内切酶 RNAaseD 两端序列和内含子切除 核苷酸 转移酶 ATP 3端加 CCA-OH 甲基化 ：某些嘌呤甲基化 。 如： A mA, G mG 还原反应 ：某些尿嘧啶还原为双氢尿 嘧啶 (DHU)。 转位反应 ：尿嘧啶转变为假尿嘧啶 (尿嘧啶由 N1转变为 C5与戊糖连接 ) 脱氨反应 ：某些腺嘌呤脱氨成为次黄 嘌呤 (I)。 稀有碱基形成 （ 2）还原反应 如： U DHU （ 3）核苷内的转位反应 如： U （ 4）脱氨反应 如： A I 如： A Am （ 1）甲基化 （ 1） （ 1） （ 3） （ 2） （ 4） 稀有碱基形成 1982年 Ceck等用纯化的细菌 RNA-pol转录 四膜虫细胞的 rRNA前体 ， 发现 rRNA前体 能进行 自我剪接 ， 变为成熟的 rRNA， 此 时并没有其他蛋白质酶的存在 。 多种单细胞生物 、 线粒体 、 叶绿体中的 rRNA和 tRNA也 具有自我催化剪接功能 ， 均是转酯反应 。 因此诞生核酶概念 。 四、核酶 (ribozyme) 核酶定义： 具有催化功能的 RNA。