基因重组技术概述

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1、 DNADNA重组技术概述重组技术概述 DNADNA重组技术前言重组技术前言一、重组一、重组DNADNA技术的诞生技术的诞生（一）重组（一）重组DNADNA技术诞生的理论基础技术诞生的理论基础 1.401.40年代明确了遗传的物质基础是年代明确了遗传的物质基础是DNADNA 肺炎链球菌肺炎链球菌3 3、5050年代末和年代末和6060年代提出了年代提出了“中心法则中心法则”和操和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码。纵子学说，并成功地破译了遗传密码。中心法则中心法则操纵子操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。（二）关键性实验技术问世为重组（二）关

2、键性实验技术问世为重组DNADNA技术奠定基础技术奠定基础 1.DNA1.DNA分子的切割与连接技术分子的切割与连接技术 2.2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 3.Southern3.Southern杂交、杂交、DNADNA序列分析和聚合酶链式反应序列分析和聚合酶链式反应二二.重组重组DNADNA技术的定义及步骤技术的定义及步骤（一）重组（一）重组DNADNA技术技术1 1、重组、重组DNADNA技术（技术（recombinant DNA recombinant DNA technology):technology):按照人的意愿，在体外对按照人的意愿，在体

3、外对DNADNA分子进行重组，分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该繁殖，以获得该DNADNA分子的大量拷贝，表达相关基分子的大量拷贝，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。（二）重组（二）重组DNADNA技术的重大意义技术的重大意义 1.1.填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。2.2.缩短了进化时间。缩短了进化时间。3.3.使人能对生物体进行定向构造。使人能对生物体进行定向构造。三、工具酶三、工具酶（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸

4、内切酶是一类能识别和切割双链是一类能识别和切割双链DNADNA分子中特定碱基顺序分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。的核酸水解酶。2.2.命名命名第一个字母（大写、斜体）第一个字母（大写、斜体）该酶的微生物属名该酶的微生物属名第二、三个字母（小写、斜体）第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名代表微生物种名第四个字母（斜体）第四个字母（斜体）代表寄主菌的株或型代表寄主菌的株或型用罗马数码用罗马数码I I、IIII、IIIIII等区分同一株具等区分同一株具 有不同特异性的酶有不同特异性的酶例例 流感嗜血杆菌中三个酶的命名：流感嗜血杆菌中三个酶的命名：Haemophilus influenzae d

5、Haemophilus influenzae d 属名属名 种名种名 株系株系 H in dH in d I I II II III III Hind Hind I I Hind Hind II II Hind Hind III III 2.2.分类分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为：是否具有修饰酶活性可分为：I I型型 IIII型型 IIIIII型型（1 1）I I型限制酶型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNADNA两种特性。两种特性。（2 2）IIIIII型酶型酶与与I I型酶特性类似，

6、也有甲基化功能，但无型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATPATP酶和酶和DNADNA解旋酶活力。解旋酶活力。在在DNADNA链上有特异位点切割，其切割位点在识别链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。位点以外。（3 3）IIII型酶型酶3.II3.II型酶型酶（1 1）IIII型酶的识别型酶的识别 识别序列一般为识别序列一般为4-64-6个碱基对，通常是反转重个碱基对，通常是反转重复顺序，具有复顺序，具有180180的旋转对称性。的旋转对称性。（2 2）IIII型酶的切割功能型酶的切割功能平末端（平末端（blunt end)blunt end)在识别顺序的对称轴上，对双链在识别顺序的对

7、称轴上，对双链DNADNA同时切割。同时切割。55端粘性末端（端粘性末端（cohesive end)cohesive end)在识别顺序的双侧末端切割在识别顺序的双侧末端切割DNADNA双链，于对称双链，于对称轴的轴的55末端切割。末端切割。33端粘性末端端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割在识别顺序的双侧末端切割DNADNA双链，双链，于对称轴的于对称轴的33末端切割。末端切割。（3 3）少数有特殊性质的）少数有特殊性质的IIII型酶型酶异源同工酶（异源同工酶（isoschizomerisoschizomer）定义：定义：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。来源不同但能识别和切割同一位点的酶

8、。同尾酶（同尾酶（isocaudarner)isocaudarner)为识别与切割顺序相互有关的酶。为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中的识别顺序之中 酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端。性末端。55特点：特点：两个同尾酶消化的两个同尾酶消化的DNADNA片段，可以相互连接，片段，可以相互连接，连接后的重组连接后的重组DNADNA分子，可以被其中一种酶识分子，可以被其中一种酶识别，也可能原来的任何一个同尾酶均不能识别。别，也可能原来的任何一个同尾酶均不能识别。5.

9、5.限制性内切酶的星号活力限制性内切酶的星号活力（1 1）定义：）定义：限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力。称星号活力。（2 2）表示：）表示：在相应限制酶的名称，右上角加一个星号（在相应限制酶的名称，右上角加一个星号（*）。）。（3 3）特点：）特点：星号活力的识别形式常对标准识别顺序中星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。两侧的碱基没有特异性。（4 4）产生的原因）产生的原因 a.a.高甘油含量（高甘油含量（5%V/V)5%V/V)b.

10、b.内切酶用量过大，一般为内切酶用量过大，一般为 100U/100U/g DNAg DNA c.c.低离子强度低离子强度25mmol/L25mmol/L d.d.高高pHpH值值 pH8.0pH8.0 e.e.含有机溶剂：含有机溶剂：DMSODMSO、乙醇、乙烯二乙醇、乙醇、乙烯二乙醇 MnMn2+2+、CuCu2+2+、CoCo2+2+、ZnZn2+2+等非等非MgMg2+2+的离子存在的离子存在 （5 5）常见容量发生星号活力的酶有：）常见容量发生星号活力的酶有：EcoREcoRI I、HindHindIIIIII、KpnKpnI I、PstPstI I、ScaIScaI、SalSalI

11、I、XmnXmnI I、HinfHinfI I、BssHBssHIIII、EcoREcoRV V7.II7.II型限制酶的用途型限制酶的用途（1 1）DNADNA重组克隆及亚克隆重组克隆及亚克隆（2 2）DNADNA杂交与序列分析杂交与序列分析（3 3）改建质粒）改建质粒（4 4）构建基因组）构建基因组DNADNA物理图谱和文库等物理图谱和文库等 （二）（二）DNADNA聚合酶聚合酶1 1、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I及其大片段（及其大片段（KlenowKlenow片段）片段）（1 1）大肠杆菌）大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I 特性：具有特性：具有3 3种酶活性种酶

12、活性c.5c.533外切酶活性：外切酶活性：能从游离的能从游离的55末端降解末端降解DNADNA成为单核苷酸。成为单核苷酸。（2 2）KlenowKlenow片段片段 从大肠杆菌从大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I中去除中去除5533外外切酶活性，即得切酶活性，即得KlenowKlenow片段。片段。其只具有其只具有 5533聚合酶活性聚合酶活性 3355外切酶活性外切酶活性 35kD76kD苦草杆菌蛋白酶裂解全酶苦草杆菌蛋白酶裂解全酶5 3外切酶外切酶5 3聚合酶聚合酶 3 5外切酶外切酶5 3聚合酶聚合酶 3 5外切酶外切酶KlenowKlenow片段片段DNADNA聚合酶聚合酶I I

13、全酶全酶应用应用1.1.催化催化DNADNA切口平移反应，置备高比活切口平移反应，置备高比活DNADNA探针。探针。(大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I）2.2.对对DNADNA分子进行末端标记（分子进行末端标记（KlenowKlenow）2.Taq DNA2.Taq DNA聚合酶聚合酶(1)(1)特性：特性：耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌来自于嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus Thermus aquaticus 中纯化而来的。中纯化而来的。5533聚合酶活性聚合酶活性 5533外切酶活性外切酶活性 最佳作用温度为最佳作用温度为75-8

14、075-80 C C 3.3.反转录酶（依赖于反转录酶（依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶，RDDPRDDP）（1 1）特性）特性催化从催化从RNARNA为模板的为模板的DNADNA聚合反应聚合反应 具具335RNA5RNA外切酶活性，能特异性降解外切酶活性，能特异性降解RNARNA DNADNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA部分部分 具具DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶（聚合酶（DDDPDDDP）的功能）的功能 能以能以mRNAmRNA为模板催化合成出互补的为模板催化合成出互补的DNADNA（cDNAcDNA）（2 2）分类）分类 禽源反转录酶禽源反转录酶 来自

15、禽或骨髓细胞瘤病毒（来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMVAMV）具有聚合酶活性及强的具有聚合酶活性及强的RNARNA酶酶H H活性活性 无无3355外切酶活性。外切酶活性。温度温度4242 C C pH8.6 pH8.6时活性较高时活性较高 鼠源反转录酶鼠源反转录酶 来自来自MoloneyMoloney鼠白血病病毒（鼠白血病病毒（M-MLVM-MLV）具有聚合酶活性及相对较弱的具有聚合酶活性及相对较弱的RNARNA酶酶H H活性活性 无无3355外切酶活性外切酶活性 温度温度3737 C C pH7.6pH7.6时活性较高时活性较高 4.4.末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶）末端脱氧核糖核酸转移酶

16、（末端转移酶）催化催化dNTPdNTP加到加到DNADNA分子的分子的33羟基端羟基端（三）（三）DNADNA连接酶连接酶1.1.定义：定义：DNA Ligases are DNA Ligases are primarily responsible for primarily responsible for joining the gaps that form joining the gaps that form in DNA during replicationin DNA during replication(i.e.,the joining of(i.e.,the joining of

17、Okazaki fragments formed by Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging discontinuous or lagging strand replication),DNA strand replication),DNA repair,and recombination.repair,and recombination.催化双链催化双链DNADNA一端的一端的3OH3OH与另一双链与另一双链DNA5DNA5的的磷酸根形成磷酸根形成33，5-5-磷酸磷酸二酯键，使具有相同粘性二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的

18、末端或平末端的DNADNA末端连末端连接起来。接起来。4.4.用途：用途：连接带匹配粘端的连接带匹配粘端的DNADNA分子。分子。使平端的双链使平端的双链DNADNA分子互相连接或与合成分子互相连接或与合成 接头相连接。接头相连接。5.5.反应例解：反应例解：（1 1）互补粘端）互补粘端DNADNA(或切口间的连接或切口间的连接)5 ACG5 ACGOHOH pAATTCGT 3pAATTCGT 3 3 TGCTTAAp 3 TGCTTAAp HOHOGCA 5GCA 5 ATPATP、MgMg2+2+T T4 4连接酶连接酶 55 ACGACGAATTCGT 3AATTCGT 3 33 TG

19、CTTAATGCTTAAGCAGCA 55（2 2）平端连接）平端连接5 C G A5 C G AOG OG p pC G T A 3C G T A 33 G C T3 G C Tp p OHOHG C A T 5G C A T 5 ATPATP、MgMg2+2+T T4 4连接酶连接酶 55 CGACGACGTACGTA 33 33 GCTGCTGCATGCAT 55（四）（四）T T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶T4 polynucleotide T4 polynucleotide kinase(T4 PNK)kinase(T4 PNK)催化将催化将ATPATP的的-磷酸转移到磷酸转移到D

20、NADNA链的链的55末端末端（2 2）交换反应）交换反应过量的过量的ADPADP使使T T4 4多核苷酸激酶将多核苷酸激酶将5-5-末端磷酸从磷酸化的末端磷酸从磷酸化的DNADNA链中转移到链中转移到ADPADP上生成上生成ATPATP，然后再从，然后再从 -3232PdATPPdATP上将标记上将标记的的 磷酸转移到磷酸转移到DNADNA链上，使其重新磷酸化。链上，使其重新磷酸化。用途用途标记标记DNADNA链的链的55末端末端连接反应连接反应（五）碱性磷酸酶（五）碱性磷酸酶alkaline phosphatase(CIAP)alkaline phosphatase(CIAP)1.1.特性

21、：特性：催化去除催化去除DNADNA、RNARNA和和dNTPdNTP的的55磷酸的反应。磷酸的反应。2.2.分类分类（1 1）细菌碱性磷酸酶（）细菌碱性磷酸酶（BAP)BAP)（2 2）牛小肠碱性磷酸酶（）牛小肠碱性磷酸酶（CIP)CIP)3.3.用途用途（1 1）在用）在用T T4 4多核苷酸激酶和多核苷酸激酶和3232P P标记标记55末端前，去末端前，去除除DNADNA或或RNARNA的的55磷酸。磷酸。（2 2）去除）去除DNADNA片段片段55磷酸以防止自身环化。磷酸以防止自身环化。AGCTTTCGAA重组重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤1.1.目的基因的获得和载体的选择目的基因的获得和载体的选择2.2.目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接3.3.重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞4.4.筛选出含重组筛选出含重组DNADNA基因分子的受体细胞克隆基因分子的受体细胞克隆5.5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化