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1、1. CR引物设计的11条要求引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2. 引物长度一般在1530碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-27bp，但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72C。GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上
2、下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580C，其Tm值最好接近72C以使复性条件最佳。4引物3端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5引物3端不能选择A，最好选择T。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的
3、引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。6. 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引
4、物之间也不应具有互补性，尤其应避免3端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其AG值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8. 引物5端和中间AG值应该相对较高，而3端AG值较低。9. G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，AG值越大，则双链越稳定。应当选用5，端和中间AG值相对较高，而3，端AG值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3，端的AG值过高，容易在错配位点形
5、成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的AG值可以用Oligo6软件进行分析）引物的5，端可以修饰，而3，端不可修饰。引物的5，端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5，端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、也高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3，端开始的，不能进行任何修饰。3，端也不能有形成任何二级结构可能。10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstrueture）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（AG。）小于58.61kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2，-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
CR引物设计的11条要求
