肿瘤的诱导分化和凋亡疗法

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1、第十六章肿瘤的诱导分化和第十六章肿瘤的诱导分化和凋亡疗法凋亡疗法人体细胞总数：人体细胞总数：1014 类型：类型：200多种多种细胞可以通过增殖来增加数目，细胞可以通过增殖来增加数目，那么细胞通过什么方法来改变那么细胞通过什么方法来改变其结构和功能呢？其结构和功能呢？由同源细胞逐渐变由同源细胞逐渐变为在形态结构、生为在形态结构、生理功能和生化特征理功能和生化特征等方面具有稳定差等方面具有稳定差异的另一类型细胞异的另一类型细胞的过程。的过程。干细胞 干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞

2、是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞 分化异常与分化异常与肿瘤干细胞肿瘤干细胞 传统观念认为,肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象 肿瘤干细胞：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。Self renewal and differentiation are random.All cells have equal but low probability ofextensive proliferation.Only cells wi

3、th selfrenewal capacity can sustain tumor growth.Distinct classes of cells exist within atumor.Only a small definable subset,the cancer stem cells can initiate tumorgrowth.Two General Models for Cancer Heterogeneity异质性1.All cancer cells are potential cancer stem cells but have a low probability of p

4、roliferation in clonogenic assays（随机模式）2.Only a small definable subset of cancer cells are cancer stem cells that have the ability to proliferate indefinitely.（干细胞模式）Origin of the Theory of Cancer Stem CellsOnly a small subset of cancer cells is capable of extensive proliferation Liquid TumorsIn vit

5、ro colony forming assays:-1 in 10,000 to 1 in 100 mouse myeloma cells obtained from ascites away from normal hematopoietic cells were able to form coloniesIn vivo transplantation assays:-Only 1-4%of transplanted leukaemic cells could form spleen coloniesSolid Tumors-A large number of cells are requi

6、red to grow tumors in xenograft models-1 in 1,000 to 1 in 5,000 lung cancer,neuroblastoma cells,ovarian cancer cells,or breast cancer cells can form colonies in soft agar or in vivo Therapeutic implications of Cancer Stem Cells Most therapies fail to consider the difference in drug sensitivities of

7、cancer stem cells compared to their non-tumorigenic progeny.Most therapies target rapidly proliferating non-tumorigenic cells and spare the relatively quiescent cancer stem cells.第一节第一节 诱导分化与肿瘤治疗诱导分化与肿瘤治疗 肿瘤细胞在一定条件和诱导分化剂的作用肿瘤细胞在一定条件和诱导分化剂的作用下可以向正常细胞转化下可以向正常细胞转化Wnt,Shh,and Notch pathways have been sh

8、own to contribute to the self-renewal of stem cells and/or progenitors in a variety of organs,including the haematopoietic and nervous systems.When dysregulated,these pathways can contribute to oncogenesis.Mutations of these pathways have been associated with a number of human tumours,including colo

9、n carcinoma and epidermal tumours(Wnt),medulloblastoma and basal cell carcinoma(Shh),and T-cell leukaemias(Notch).Pathways involved in self-renewal that are deregulated in cancer cells诱导分化剂诱导分化剂 1.极性化合物:包括二甲亚砜(DMSO)2.佛波酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13 acetate，TPA)。3.维生素D3及其衍生物4.cAMP及其衍生物5.细胞因子:包括G-CS

10、F、GM-CSF、IFN、TGF-、TNF、6.芳香族脂肪酸:包括桂皮酸、苯丁酸、苯乙酸及其衍生物等。7.抗肿瘤药物:包括MTX、DDP、Ara-c、三尖杉酯碱、抗肿瘤抗生素、地塞米松等。8.中药提取物及复合制剂:包括姜黄素、人参总皂甙。9.维A类化合物:10.其它类:包括5-氮杂-2-脱氧胞核苷(ADC)、蛋白磷酸化剂(银毛酸)、星形孢菌素、乳香酸、三氧化二砷等。全反式维甲酸All-trans-retinoic acid 全反式维甲酸(ATRA)，也叫做维A酸。其抗肿瘤作用的证实被誉为九十年代国际抗癌药物的三大发现之一，具有很强的诱导分化肿瘤细胞作用，备受国际国内医药界的关注，是目前国内治疗

11、急性早幼粒细胞白血病、骨髓异常增生（白血病前期）尤其是早幼粒细胞白血病的临床首选药物。ATRA联合三氧化二砷治疗APL 位于15号染色体上的早幼粒白血病基因与17号染色体上的维甲酸受体基因易位，形成特定的融合基因，导致急性早幼粒细胞白血病This schematic presentation of the translocation(15;17)(q22;q12),characteristic of APL(M3),involves the genes PML-RAR-alpha 维甲酸和砷剂通过不同的途径，靶向作用于该型白血病的同一关键致病基因编码的蛋白质。因此提出两药共用的协同靶向治疗设想

12、思考题 细胞分化、肿瘤细胞分化特点细胞分化、肿瘤细胞分化特点 干细胞、肿瘤干细胞干细胞、肿瘤干细胞 诱导分化剂诱导分化剂第三节第三节 诱导凋亡与肿瘤治疗诱导凋亡与肿瘤治疗 1972年Kerr Apoptosis(凋亡)编程性细胞死亡(programmed cell death，PCD)细胞凋亡是形态学概念，编程性细胞死亡大多表现为细胞凋亡，但并非所有编程死亡的细胞都有细胞凋亡的形态特征 Normal white blood cell Apoptotic white blood cellDuring apoptosis (programmed cell death)cells bleb and

13、eventually break apart without releasing contents.Apoptosis during the metamorphosis of a tadpole into a frog.The cells in the tadpole tail are induced to undergo apoptosis stimulated by the increases in thyroid hormone that occurs during metamorphosisC.elegans是研究PCD的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。1030 cells gen

14、erated but 131 cells dieTypes of cells that undergo apoptosisApoptosis in the embryonic mouse paw.Apoptosis occurs between 12.5 to 14.5 days in embryogenesisApoptosis and normal morphogenesis.TUNEL assay(immunodetection)detects breaks in DNA as cells undergo apoptosis+1 dayApoptosis is also importan

15、t in the development of the nervous system2002年10月7日英国人Sydney、美国人Horvitz和英国人Sulston，因在PCD方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。H.Robert HorvitzJohn E.Sulston Sydney Brenner 细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别特征特征 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死诱导因素诱导因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 强烈刺激强烈刺激膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早期即丧失早期即丧失细胞体积细胞体积 减少、固缩减少、固缩 增大肿胀增大肿胀染色质染色质 凝聚成半月

16、形凝聚成半月形 稀疏成网状稀疏成网状细胞器细胞器 无明显变化无明显变化 肿张破坏肿张破坏溶酶体溶酶体 保持完整保持完整 破坏外溢破坏外溢细胞形状细胞形状 形成凋亡小体形成凋亡小体 破裂成碎片破裂成碎片基因组基因组DNA DNA 有控降解有控降解 随机降解随机降解大分子合成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要基因调控基因调控 有有 无无受累范围受累范围 单个细胞丢失单个细胞丢失 成群细胞死亡成群细胞死亡后果后果 不引起炎症反应不引起炎症反应 引起炎症反应引起炎症反应意义意义 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方式病理死亡方式诱因形态分子水平转归STAGES OF APOPTOSISSher

17、man et al.,1997一一.凋亡相关基因及端粒酶凋亡相关基因及端粒酶 bcl-2家族 p53基因 C-myc基因 Fas/Fas-L系统 Caspase(半胱天冬蛋白酶)家族 端粒和端粒酶 Apoptosis:PathwaysDeath LigandsEffector Caspase 3Death ReceptorsInitiator Caspase 8PCDDNA damage&p53Mitochondria/Cytochrome CInitiator Caspase 9“Extrinsic Pathway”“Intrinsic Pathway”Bcl-2 FAMILY-Bcl-2-

18、Bcl-XL-Mcl-1-*-Bax-Bcl-XS-Bak-Bad-*Anti-apoptoticPro-apoptotic 细胞内Bax高表达时，细胞对死亡信号敏感，加速细胞凋亡，当Bcl-2高表达，Bcl-2可与Bax形成异源性二聚体，抑制细胞凋亡。所以Bcl-2Bax的比例对决定细胞凋亡的敏感性起重要作用，抑制凋亡因子/促进凋亡因子的总比率，最终决定细胞的的生存或死亡。Bcl-2在肿瘤中的表达与肿瘤的发生在肿瘤中的表达与肿瘤的发生 Bcl-2在多种肿瘤中的表达已得到证实。一般来说，Bcl-2阳性的肿瘤要比Bcl-2阴性的肿瘤预后差。在一些比较常见的恶性肿瘤中，Bcl-2表达经常阳性的有：

19、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓白血病伴有原始细胞危象者和急性髓白血病几乎l00阳性，滤泡淋巴瘤80阳性，T、B非霍奇金淋巴瘤65阳性，霍奇金淋巴瘤40阳性，乳腺癌80阳性，神经母细胞瘤40阳性，鼻咽癌80阳性，前列腺癌75阳性，肺鳞癌25阳性，肺腺癌10-15阳性P53 野生型p53基因为肿瘤抑制基因，编码p53蛋白，该蛋白在G1期参与检查点的作用，负责检查染色体DNA是否有损伤。发现DNA损伤，即阻止细胞进入细胞周期，并启动DNA修复机制，如果修复失败，p53蛋白启动细胞凋亡机制 Fas/Fas-L fas又称作APO-1，属TNF受体家族。1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。fa

20、s基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合激活caspase。Ligand-induced cell death“The death receptors”Ligand-induced trimerizationDeath DomainsDeath EffectorsInduced proximity of Caspase 8Activation of Caspase 8FasLTrailTNFC-myc 具转录因子活性，与DNA结合调节其他基因的转录活性。其编码一个寿命很短的DNA结合蛋白，几乎在所有的肿瘤细胞中表达异常。IHC image of

21、 c-Myc staining in human breast carcinoma C-myc-DNA complexC-myc在肿瘤中的活化 C-myc蛋白具有双重功能，既可以激活介导细胞增殖，也可以激活介导细胞凋亡，这取决于细胞接受某种信号以及所处的生长环境。C-myc低水平时，细胞生长停滞；C-myc表达，且有血清生长因子存在时，细胞进入增生状态；C-myc表达，但取消生长因子(血清饥饿)时，细胞发生凋亡，C-myc可与bcl-2协同转化细胞，bcl-2抑制C-myc所致的细胞凋亡，但不影响C-myc促有丝分裂的增殖作用。Fas和C-myc阳性表达与瘤细胞高分化趋向一致，C-myc可协助

22、Fas促进细胞凋亡 Caspase家族 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase，),在天冬氨酸残基之后将底物裂解.Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid，Asp，proteases)由单一3050kd的无活性前体在Asp-X的肽键被切割，生成1720kd和1012kd的大小亚基，酶的活性形式是大小亚基组成的四聚体；Caspase蛋白水解酶有2个特征：、都是半胱氨酸蛋白酶；、作用部位都在天冬氨酸残基后的位点Caspase家族的组成家族的组成 1、Caspase

23、-2，-8，-9，是细胞凋亡的起始Caspase.(initiator)2、Caspase-3，-6，-7，执行细胞凋亡，是效应Caspase.(effector)这两组Caspase在细胞凋亡中缺一不可。3、由Caspase-1，-4，-5组成，与细胞凋亡的关系不是很密切，可能与多种炎症因子的成熟有关 Caspase classification（Zimmermann 2001）Executioner or effectorAutocatalytic initiator使抑制凋亡因子失活，如使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD CAD:Caspases activated dexyribo

24、nuclease ICAD:Inhibitor of CAD破坏细胞结构，如核纤层破坏细胞结构，如核纤层（Lamina）Caspase 如何杀死细胞？如何杀死细胞？SUBSTRATES for CASPASES.PARP.DNA-PK.pRb.Lamins.NuMA.Fodrin.-Aktin.Mdm2.Cyclin A2.Presenilin.Others 端粒和端粒酶 端粒端粒端粒端粒中心粒中心粒图图 真核生物染色体真核生物染色体 末端复制问题末端复制问题端粒酶(telomerase)的激活。端粒酶是一种核糖-核蛋白复合体，其中RNA和蛋白质是端粒DNA合成所必须的。能以自身的RNA为模板

25、，逆转录合成DNA，以补偿细胞分裂时染色体末端缩短，解决“末端复制问题”肿瘤细胞中端粒的动态 第一期：开始缩短，保护功能。第二期：端粒功能异常，DNA监控机制使细胞停滞，凋亡 第三期：DNA检测缺陷，端粒DNA继续丢失，细胞基因组更加不稳定。第四期：端粒酶活性升高，端粒功能得以重建。大部分肿瘤在发育到第四期前不易检测到三、凋亡的检测方法 1、形态学检测 2、生物化学检测 3、分子水平检测1、细胞凋亡的形态学检测细胞凋亡的形态学检测（1）光学显微镜和倒置显微镜）光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染

26、色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。（2）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342;HO,Hoechst 33258;DAPI。（3）电子显微镜观察）电子显微镜观察Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400）电镜观察电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡

27、结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。2、生物化学检测（1）磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）（2）线粒体膜势能的检测 JC-1 （3）DNA片断化检测 DNA Ladder 测定 DNA含量分析 （4）TUNEL法（1 1）磷脂酰丝氨酸（）磷脂酰丝氨酸（PSPS）外翻分析）外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法）磷脂酰丝氨酸（磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PSPhosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V能与PS高亲和力特

28、异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）Annexin V-FITC FluorescencePI Fluorescence（2）线粒体膜势能（）线粒体膜势能（mt）线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、JC-1、TMRM等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。Mitochondrial staining with JC-1

29、The dye undergoes a reversible change in fluorescence emission from green to red as mitochondrial membrane potential increases.Cells with high membrane potential promote the formation of dye aggregates,which fluoresce red;cells with low potential will contain monomeric JC-1 and fluoresce green.There

30、fore,the red/green ratio can help to identify a cells status.the mitochondria stained with JC-1 in a normal cell(left panel)and the mitochondrial potential collapse induced by hydrogen peroxide in NIH-3T3 cells(A:Basal state;B:After Hydrogen Peroxide).（3）DNA片断化检测(DNA ladder)：染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成1

31、80200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱DNA含量分析DNA Damage2N4N2N4NG1SG2/MSub G1 accumulation（4）TUNEL DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（Terminal deoxyribonucleic transferase，TdT）的作用下，将标有标记物(如地高辛、生物素或荧光素等)的脱氧核苷酸(如dUTP)转移到3-OH末端，再进行显色显示凋亡细胞 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT mediated dUTP nick end lab

32、eling,TUNEL）The TACS TdT kits contain a highly purified form of the TdT enzyme for the enzymatic incorporation of biotinylated nucleotides.Biotin labeling is achieved using Streptavidin-horseradish peroxidase,and colorimetric substrates diaminobenzidine(DAB)or TACS Blue Label3、分子水平检测（1）Caspase分子的检测（

33、2）凋亡相关分子的检测 促凋亡分子 抑凋亡分子（2）凋亡相关分子的检测 促凋亡分子Bax,Bcl-Xs,Bak,Bad,Bid,AIF,Apaf-1和cytochrome c等 抑制凋亡分子Bcl-2,Bcl-XL和bcr/abl kinase等 综合解决方案凋亡或坏死？凋亡或坏死？死亡受体通路或线粒体通路？死亡受体通路或线粒体通路？具体的调控分子机制具体的调控分子机制Annexin VTunelDNA contentCaspase 3,8,9JC-1 stainBax/Bcl-2Cytochrome C思考题 细胞凋亡的生理意义 凋亡与坏死的区别 细胞凋亡的膜受体和线粒体途迳 细胞凋亡常用的检测方法及原理