湿热灭菌工艺验证方案

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1、 湿热灭菌工艺验证方案山东鑫科生物科技有限公司目录1. 引言32. 灭菌设备和公用系统的测试3 2.1 灭菌柜特性3 2.2 灭菌介质4 2.3 容器类别4 2.4 设备压力表、安全阀等合格证5 2.5 其他合格证见附图53. 空热载和热穿透实验6 3.1 灭菌工作程序6 3.2 灭菌对象6 3.3 验证目的6 3.4 实验过程63.4.1 灭菌柜准备阶段63.4.2 操作步骤73.4.3 热载实验73.4.4 培养液在灭菌柜内的排放73.4.5 探头在灭菌室内的排放83.4.6 实验结果9 3.5 热穿透试验3.5.1 验证步骤3.5.2 合格标准3.5.3 实验结果103.5.4 结果分析

2、4. 生物指示剂实验 4.1 生物指示剂说明 4.2 生物指示剂实验步骤 4.3 实验结果 4.4 验证合格标准 4.5 结果分析及评价 4.6 偏差及评估意见5.附图 1. 引言 概述本公司采用张家港市环宇制药设备有限公司生产的MQS0.25型灭菌柜，张家港市环宇制药设备有限公司始建于2001年，是国内灭菌柜设计制造领域的佼佼者，公司拥有D1、D2压力容器制造许可证，医疗器械生产企业许可证，通过了ISO9001质量管理体系认证，所生产的各种消毒灭菌设备涵盖了制药、医疗、生物、食品等领域，符合国家GMP验证和特种设备安全监察、卫生防疫等部门的相关要求。本公司主要对瓶装液体培养基进行消毒，该灭菌

3、柜采用饱和蒸汽的方式进行灭菌，该设备广泛适用于制药、医疗、科研等行业对生物制品、医疗器械、无菌衣物、工器具、器皿、培养基等物品的高温灭菌操作和冷却干燥处理。性能简介该设备严格按照压力容器规范（GB150）和“脉动真空灭菌柜”标准设计制作。主体为卧式矩形内外双层结构；前期采用脉动真空排气方式消除灭菌室内残存冷空气对温度的影响（排除率99%），既加快了升温速度，减少了对被灭菌物品的损伤，又充分保证了灭菌温度均匀性；灭菌后真空抽湿结合套层烘干使物品干燥和冷却。灭菌器装载能力： 50ml 420瓶2 .灭菌设备和公用系统的测试 2.1 灭菌柜特性 2.2灭菌介质：饱和水蒸汽。调制0.5麦氏的菌悬液，放

4、入玻璃瓶中，放入蒸汽式的高压锅，121，高压30min后，将细菌转种到细菌培养基中，培养48小时，没有细菌生长，说明高压蒸汽灭菌有效。 2.3 容器类别为一类，套层和内层温度和压力试验（见灭菌柜产品技术特性）符合标准GB150-1998、YY/T0084-2-92、JB/T4709-2000、容规，因此此设备压力设计安全。 2.4该设备压力表、安全阀等合格证如图 2.5其他合格证明见附图。3.空热载和热穿透实验 3.1灭菌工作程序：准备阶段：打开蒸汽、自来水、压缩空气等能源管道上的阀门；每天第一次使用前排除蒸汽管道内的冷凝水；确认各种能源压力符合设备工作要求；打开电器箱中得电源开关并确认正常。

5、操作阶段：打开电源，确认触摸屏进入主操作界面。设定参数，然后按门操作键进入门操作界面。打开门后装入灭菌对象。关闭前门。启动阶段：在主操作界面上，按自动/手动选择键，选择灭菌程序。确认后进入灭菌阶段。结束阶段：灭菌完成后，在主操作界面按门操作键进入门操作界面，解除门密封状态。然后在后操作界面上，按开门键，打开后门，取出灭菌后的物品。最后，在后操作面板上按关门键，关闭后门。至此，完成一个灭菌周期。清洁阶段：清洗灭菌室；关闭各种能源阀门；关闭电源。本方案依据湿热灭菌的指导原则制订，主要进行设备灭菌程序的验证。 3.2 灭菌对象本公司主要生产临床检验细菌用的试剂盒、培养瓶，以及配套的培养液与稀释液。需

6、要高压灭菌的主要是培养液与稀释液。 培养液成分：重蒸水、脑心浸液（浓度为3.7%） 稀释液成分：重蒸水、氯化钠（浓度为9%）原材料名称厂家名称规格批号脑心浸液英国OXOID公司500g/瓶氯化钠天津市大茂化学试剂厂500g/瓶脑心浸液主要作用是为细菌提供碳源及氮源，高温高压下对其没有影响。氯化钠主要为稀释细菌用，并且高温高压下氯化钠化学性质稳定。因此这两种物质适于高压高温灭菌的方法。 3.3 验证目的安装确认主要检查灭菌柜安装符合设计要求，灭菌柜有关资料和文件符合GMP 的管理要求。运行确认主要检查灭菌柜各单元的性能及整机运行是否达到供货单位设计要求。性能确认主要验证灭菌柜在装载情况下不同位置

7、的热分布状况，确定灭菌柜中冷点的位置；确定产品灭菌程序有关的参数，如温度、压力及灭菌时间等，以确保产品灭菌后达到低于106 的微生物污染率，同时验证灭菌器运行的可靠性及灭菌程序的重现性。3.4 实验过程灭菌柜准备阶段： 3.4.1 在打开电源之前，必须做好准备工作； （1）、检查设备状态是否良好； （2）、打开自来水阀门，包括进水泵用自来水和真空用自来水； （3）、关闭水箱排放阀； （4）、检查空气压缩机放气阀是否已关闭，关闭后再打开空气压缩机，压缩机工作几分钟后，达到设定压力，停止工作，看压缩机上压力表读数是否在0.50.8Mpa范围内，再看灭菌柜上进气口处压力表读数是否也在0.50.8Mp

8、a范围内，都正常后再进行下面操作。 3.4.2 操作步骤 （1）、打开控制电源：按下主操作面板上的电源按钮，确认触摸屏后进入主操作界面，此时，PLC上电后先检测四个门接近开关是否都亮灯。若都亮，开始往水箱注水。大约一分钟后，显示低液位，并显示制蒸汽，大约再过一分钟，显示高液位，停止进水。进水时间一般不超过三分钟，若超过三分钟，检查设备是否有异常情况。进水过程中，观察套层压力表读数变化，若其读数超过0.2Mpa，为不正常，此时应关闭设备电源，打开水箱排放阀。 （2）、参数设置：在参数设定界面上，按工艺要求设定好工作压力、灭菌温度、灭菌时间、干燥时间等工作参数，选择好所用灭菌程序，参数设定完成并确

9、认无误后，按该界面的确定键返回主操作界面。 （3）、物品装载：在门操作界面上，按开前门键，打开设备前门，将待灭菌物品从前门装入灭菌室内，装载完成后，关闭前门。确认前门已关好，且该界面前、后门关闭指示灯显示正常。按该界面上的门密封键并确认门密封指示正常。 （4）、启动灭菌程序：在主操作界面上，按自动键，选择自动程序，按启动键，设备开始按选定的设定程序运行，自动进行灭菌操作。灭菌过程中，应注意各参数变化情况，以及设备运行情况，若出现异常，应根据情况，采取适当措施。灭菌结束后套层开始排放蒸汽，待灭菌室压力降低到70Kpa左右时，停止程序。然后，选择手动程序，按其中的排放键，灭菌室开始排放蒸汽，其压力

10、逐渐降低到10Kpa左右。再点动按真空键，让灭菌室压力降到0. （5）、物品卸载：在主操作界面按门操作键进入门操作界面。在该界面上，按门真空键3-5秒，以解除门密封状态，然后按开前门键，打开前门，取出灭菌后的物品。 （6）、设备使用结束后，清洁灭菌室及设备，关闭电源、关闭自来水阀门，关闭压缩机，打开水箱排放阀，打开压缩机放气阀。 3.4.3 热载实验： （1）、 首先空载运行三次验证灭菌柜内温度的均匀性；（2）、 将瓶装培养液密封后，排放在不锈钢托盘上，每瓶之间留有3cm的空间放入灭菌室，作为最小装载运行三次，每次都是完全冷却后再运行第二次；（3）、 将瓶装培养液密封后，排放在不锈钢托盘上，每

11、瓶之间不留空间放入灭菌室，作为最大装载运行三次，每次都是完全冷却后再运行第二次；（4）、 将瓶装培养液密封后，排放在不锈钢托盘上，每瓶之间留有1cm的空间放入灭菌室，典型装载运行三次，每次都是完全冷却后再运行第二次；（5）、 记录每次实验各点的温度。 3.3.4 培养液在灭菌柜内的排放（如下图） 3.4.5 探头在灭菌室内的排放（数字代表几个探头的位置如下图） 探头采用北京赛亿凌科技有限公司生产的STT-R系列铂电阻温度传感器，温度检测范围为-50-250，精度为0.1。 3.4.6 实验结果项目最冷点和腔室平均温度差值空载热分布第一次各个点平均差值1.0。靠近管壁与热源处温度较高。其他部位基

12、本一致空载热分布第二次各个点平均差值1.0。靠近管壁与热源处温度较高。其他部位基本一致空载热分布第三次各个点平均差值1.0。靠近管壁与热源处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（最小装载）第一次各个点平均差值1.0。靠近管壁与热源处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（典型装载）第一次各个点平均差值1.0。靠近管壁与热源处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（最大装载）第一次各个点平均差值1.0。靠近管壁与热源处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（最小装载）第二次各个点平均差值在2.0。靠近管壁与进气孔处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（典型装载）第二次各个点平均差值在2.0。靠近管壁与

13、进气孔处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（最大装载）第二次各个点平均差值在2.0。靠近管壁与进气孔处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（最小装载）第三次各个点平均差值在2.0。靠近管壁与进气孔处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（典型装载）第三次各个点平均差值在2.0。靠近管壁与进气孔处温度较高。其他部位基本一致装载热分布（最大装载）第三次各个点平均差值在2.0。靠近管壁与进气孔处温度较高。其他部位基本一致方案实施： 崔陈波 日期：2011.3.203.5 热穿透试验(灭菌程序的验证) （与生物指示剂同时进行）目的：热穿透试验是在热分布试验的基础上，确定装载中的“最冷点”，并确认该点在

14、灭菌过程中获的F0不小于8。 3.5.1 验证步骤测试过程：将1支探头置于由热分布试验确定的冷点位置，其余探头按温度探头装载图均匀分布在灭菌产品中并固定好(铂电阻安装时不要与塑料袋接触)，记下探头编号，关上灭菌柜的门，运行灭菌程序，启动验证仪记录灭菌温度、F0，每30s 采集一次，直到灭菌程序结束。装载类型：10 ml螺口瓶装培养液,包含最小装载、典型装载和最大装载三种，每种重复三次。以检查其重现性。灭菌程序：121，30 min3.5.2 合格标准对于此灭菌程序产品来说，腔室内各点（包括最冷点）F08，冷点F0值和产品F0 的平均值之间的差值不超过2.5。3.5.3 实验结果项目最冷点F0差

15、值装载热穿透（最小装载）第一次8.40.1装载热穿透（典型装载）第一次8.10.4装载热穿透（最大装载）第一次8.90.4装载热穿透（最小装载）第二次8.20.3装载热穿透（典型装载）第二次8.30.2装载热穿透（最大装载）第二次9.00.5装载热穿透（最小装载）第三次8.20.3装载热穿透（典型装载）第三次8.40.1装载热穿透（最大装载）第三次9.00.53.5.4 结果分析：实验结果符合标准，验证合格。4. 生物指示剂试验 4.1 生物指示剂说明 生物指示剂：生物指示剂是一类特殊的活微生物制品,可用于确认灭菌设备的性能,灭菌程序的验证,生产过程灭菌效果的监控等. 对特定灭菌处理有确定的抗

16、力，并装在内层包装中可供使用的染菌载体。生物指示剂重量质量特性：a、芽孢含量；b、D值。本次使用的指示剂为四环牌ME-压力蒸汽灭菌生物指示剂，由军事医学科学院微生物流行病研究所研制，北京四环卫生药械厂有限公司出品，生产地址：北京市丰台区东大街20号。型号为ME-型，批准文号：卫消字（2002）第0146号，执行标准：Q/SHY 03-2002，卫生许可证：京卫消证字2002第0055号，ISO9001:2000国际质量管理体系认证企业，批号：，本品由嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC7953)菌片，培养基（密封在玻璃管内）及塑料外壳组成自含式生物指示剂。菌片含菌量为51055106cfu/片。D值为1

17、.31.9分钟。在1210.5饱和蒸汽条件下，存活时间3.9分钟，杀灭时间19分钟。该产品功能：不需要无菌操作，培养简单； 在24个月内保证稳定的芽孢数； 根据标签的化学指示剂变化，可确认是否灭菌完全； 经24小时、48小时或4天培养，可确认灭菌效果，并且信赖度高。使用方法：a. 将生物指示剂管放入标准检测包的中心，置于灭菌器的规定位置； b. 按规定的灭菌温度和时间进行灭菌处理。 c. 灭菌结束即刻将指示剂管取出，盖朝上垂直握于手中，用镊子夹住指示管下端尖部，将管内瓯夹碎，让培养液流出，浸没菌片，充分振摇。然后将置于56培养箱内或配套的微型培养器内，同时放一支未经灭菌处理的生物指示管作为阳性

18、对照，一并培养48小时，观察结果。 结果判定： 培养后当生物指示剂管内培养液由紫色变为黄色，即表示有菌生长，判定灭菌不合格；如仍为紫色即表示无菌生长，同时阳性对照生长正常，判定为灭菌合格。注意事项：1、生物指示剂管从压力蒸汽灭菌器内取出后需在室温下放10min左右，再将安瓯夹碎； 2、未用完的生物指示剂随时放入4冰箱内； 3、本生物指示剂在4条件下存储。 4.2 生物指示剂实验步骤1、选用嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stereatherno philus,测定生物指示剂的D值(1.8)；2、将验证用生物指示剂接种入被验证产品的包装容器中（如图2），装有生物指示剂的容器要紧挨于装有测温探头

19、的容器，在灭菌设备的最“冷点”处必须放置生物指示剂。样品总数为20只。 图2图3图43、 验证时，按产品设定的灭菌程序运行，灭菌后样品经过滤处理后56培养48h、计数。共进行3次试验。（溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基）。 图3为灭菌后将安瓯夹碎 图4为将生物指示剂培养液放入56培养箱内培养48小时接种量计算：根据SLRF0/ D bi8/1.8=4.44，SLR=lgAlgB，B2.303lg(20/19)0.0513计算得A10 3.15 (CFU/瓶)。即生物指示剂每包装的接种量约为1.5103CFU/瓶。4.3 实验结果D值验证结果：灭菌方法微生物温度（）介质或样品D值（min）蒸气灭菌嗜

20、热脂肪芽孢杆菌1055葡萄糖水溶液87.8蒸气灭菌嗜热脂肪芽孢杆菌1215葡萄糖水溶液2.4蒸气灭菌嗜热脂肪芽孢杆菌121生理盐水3.0蒸气灭菌产芽胞梭状芽孢杆菌1055葡萄糖水溶液1.3测定F0值，t=1（min）时间(min)012345678-38温度()100102104106108110112114115时间(min)3940414243444546温度()114112110108106104102100F0=1*(10(100-121)/10)+(10(102-121)/10)+(10(104-121)/10)+.+(10(100-121)/10) =8.41(min)规定F0=8

21、合格，8.41=8，因此该灭菌柜符合标准。4.4 验证合格标准在设定的F0 条件下，121，30min灭菌后产品的污染概率低于10-6。20只生物指示剂均应呈阴性，阳性对照组应明显长菌，否则，验证试验无效。3次试验结果应一致，否则应分析原因或重作。4.5 结果分析及评价生物指示剂编号培养结果1234567891011121314151617181920第1次阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性第2次阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性第3次阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性

22、阴性阴性阴性20只生物指示剂均为阴性，阳性对照孔为阳性。验证合格。在121，30min可以保证百分百的无菌。4.6 偏差及评估意见偏差报告表测试中出现偏差的位置:托盘中间位置附近偏差号.209偏差描述:出现偏差的瓶位主要在冷点位置左右。发现偏差人/日期:崔陈波 2011.4.15审核人/日期:张敏 2011.4.16调查结果, 整改措施和总结:当瓶位之间空间大时，出现偏差的几率很小。整改措施：严格控制每次高压瓶的数量。填写人/日期:崔陈波 2011.4.16审核人/日期:张敏 2011.4.16负责人:崔陈波预计解决日期:2011.5.1总结:在保证设定参数一定的情况下，可以认为已完全灭菌。编写人: 崔陈波日期:2011年5月1日批准人/日期:张敏 2011.05.02批准人/日期:常家广 2011.05.02工程部：常家广质量保证部：崔陈波4.5验证结果及结论参加验证人员清单姓名职务参加项目签字备注庞超技术质量部经理热分布运行试验庞超验证合格崔陈波实验室主管生物指示剂试验崔陈波验证合格5验证报告最终批准验证人批准人崔陈波张敏 5、附图