ERα调节剂高通量筛选模型的建立

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1、ER a调节剂高通量筛选模型的建立张倩1 郑智慧2 路新华2范玉玲2水小溪1 赵宝华1 张华2 贺建功2(1.河北师范大学 生命科学学院 河北 石家庄 0500162.华北制药集团新药开发有限责任公司 河北 石家庄 050013)摘要：目的建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因的细胞瞬时转染的ER调节剂高通量 筛选模型。方法 利用RT-PCR技术从脂肪的总RNA中扩增ERa基因配体结合区(ligand bingding domain ER a LBD)序列，构建表达载体pBind-ER a的嵌合表达载体。与含GAL4相应 元件的报告质粒共转染细胞系，通过检测荧光素酶基因的表达状况评价化合物对ER

2、a的调节 活性。结果 成功构建pBind-ER a表达质粒，并且通过报告质粒与表达质粒之间的比例和宿 主细胞条件的优化，得到了最佳的共转染条件。在该模型上激动剂阳性药雌二醇能剂量依赖 地提高荧光素酶的表达，最大上调倍增数超过25倍；拮抗剂阳性药它莫昔芬能有效地拮抗雌 二醇的活性，最大拮抗活性可达8倍。此外该模型被微量化为384孔板。结论ER调节剂的筛 选模型灵敏、稳定， 可以快速进行多种来源的化合物药物的筛选。关键词ERa ,激动剂，拮抗剂，共转染，高通量筛选ABSTRACT: OBJECTIVE Estrogen Receptor (ER) are a member of superfami

3、ly of ligand-activated transcription factors which play critical roles in many biological processes ， to screen the modulator of Estrogen Receptor alpha for mechanism research and drugs development， a high-throughput screening model of Estrogen receptor alpha modulator based on the Transient transfe

4、ction was established. METHODS ERa LBD gene was obtained by RT-PCR, and subcloned to p GEM-T easy Vector for sequence, then the ERa LBD fragment was excised by restriction enzymes and inserted into pBind promoter Vector to construct expression vector pBind -ERa LBD. The vector pBind - ERa LBD was tr

5、ansiently cotransfected with pGl3-Gal4 into L02 cell to assay the expression levels of luciferase. RESULTS After optimizing, an ERa LBD modulator screening model was established successfully. Estradiol and Tamoxifen could induce the expression of luciferase in a dose-dependent manner. CONCLUSION Thi

6、s method can be used for high-throughput screening for the modulator of ERa.KEY WORDS:ERa, agonist, antagonist, cotransfection, high-throughput screening雌激素受体(Estrogen Receptor ER)是类固醇激素受体超家族的成员之一，是 一种配体依赖性转录因子,它与雌激素特异性结合,通过雌激素应答元件( EREs) 来调节基因的转录。人类ER(hER)有两种亚型，即ERa和ER0 ,在人体的中枢 神经系统、血管、乳腺、子宫、骨、肺、肾、

7、肠、卵巢、前列腺、膀胱2等部位 均有表达。ERa是ER家族中表达比较广泛的一个亚型，而且它的转录活性也大 于ERp。ER配基即调节剂可分为3类：激动剂、拮抗剂、选择性雌激素受体 调节剂(selective estrogen receptor modulator SERM)，主要用于治疗骨质疏松症 4, 5、乳腺癌6,7,8 ,9等等，并逐渐成为大家关注的药物靶点。因此，许多大的医药 公司纷纷开展了以ER为靶点的药物研发，其中分别由Eli Lilly公司和Pfizer公司 开发SERMs的代表性药物raloxifene hydrochloride和激动剂二芳基四氢萘类衍 生物lasofoxife

8、ne tartrate，主要用于绝经后妇女骨质疏松症和更年期综合征的治疗 1011。而由英国Astra Zeneca公司研发的拮抗剂甾体纯抗雌激素Fulvestrant，用于 治疗绝经后妇女晚期、激素敏感性乳腺癌12，Tamoxifen用于治疗晚期乳腺癌13。 而且最近报道ER的配体也在治疗心血管疾病方面表现出好的效果14。因此，寻 找新的ER调节剂对新药的研发和ER的生理功能功能研究都具有重要的意义。哺乳动物细胞单杂技术也称为嵌合蛋白表达基因方法，该技术是近些年发展 起来的，主要应用于核受体功能及其配体生理活性筛选和评价的新技术15。本 文报道了一种基于哺乳动物单杂交的新的报告基因高通量的E

9、R调节剂筛选方法 的建立和优化结果。1 材料和方法1.1 质粒、菌种与细胞株pGEM-T easy Vector,pBind promoter vector购于Promega 公司；pGL3-Gal4报告质 粒为本实验室已构建；3T3L1细胞,HCT-15细胞和Hela细胞由本实验室保存； 人正常肝细胞株L02购自上海细胞所。1.2 主要仪器GeneAmp PCR System 9600 (Backman);凝胶成像系统 FUJ IFILM LAS23000 (富 士) ;CO2 培养箱(美国科峻仪器公司);1420 VICTOR2 Multilabel Counter (美国PE 公司) 。

10、1.3 工具酶与主要试剂Ex-Taq , DL2000 marker ,入-DNA Hind III marker ,DNA Ligation Kit (TaKaRa); 限制性内切酶BamH I ,Kpn I , Luciferase Assay System(Promega);胎牛血清、 PRMI 1640 培养液(Hyclone) ; lipofectamineTM 2000 ,Superscript n Reverse Transcriptase ( Invitrogen), 肝总 RNA(Clontech) ,estradiol(Sigma),Tamoxifen(购自 扬子江药业集团

11、有限公司)。1.4 ERa LBD片段的扩增用 SuperscriptTM Reverse Transcriptase 试剂盒对肝总 RNA 进行反转录,再以 cDNA为模板进行PCR ,ERa LBD基因的上游引物和下游引物分别为：5Z -A - A TGGATCCTATCTG CTGGAGACATGAGAGC-3z , 5Z - AATGGTACCTC AGACCGTGGCAGGGAAAC-3z . ERa LBD 片段PCR扩增程序:94 C预变性5 min ;94 C 变性30 s , 64 C 退火30 s ,72 C 延伸60 s ,20 个循环，降0.5 C /循 环;94 C

12、变性30 s , 54 C 退火30 s ,72 C 延伸60 s ,20 个循环;72 C 延伸 10 min ; 反应终止于4 C。1.5 pBind -ERa LBD质粒的构建、转化和提取将PCR产物连接到pGME-T easy Vector,送上海生工测序。将序列正确的 ERa基因片段用BamH I、Kpn I双酶切并与pBind Vector连接，然后进行 Kpn I、BamH I双酶切鉴定。并用QIAGEN-tip 100进行大提质粒，电泳检测所 提的质粒，测260nm和280nm处的OD值进行质粒的定性和定量。1.6 细胞培养细胞用含10 %胎牛血清、1 X105 u/L青霉素和

13、100mg/L链霉素的PRMI 1640培养基,37 C,5 % CO2培养箱中培养。1.7 瞬时转染和报告基因检测将待转染的细胞株以3 X105 个/mL细胞数接种细胞于96孔板,24h后将 培养液换成含10 %胎牛血清的无双抗的PRMI 1640培养基，用lipofectamineTM 2000将重组质粒pBind - ERa LBD、pGL3- Gal4共转染入细胞中。6h后加入不 同浓度的阳性药诱导刺激,DMSO作为空白对照。给药24h后裂解细胞,1420 Multilabel Counter 检测荧光素酶的表达活性。荧光素酶的表达诱导倍增为加药 组的荧光素酶的活性与空白对照(DMSO

14、)的比值。2 结果2.1ERa LBD 基因序列的克隆用Superscript Reverse Transcriptase 试剂盒对肝组织的总 RNA (Clontech)进行反转录，再以cDNA为模板进行PCR ERa LBD基因的扩增， 电泳分析说明扩增的片段约950bp ( Fig. 1)，与预期结果大小相符。12图1ERa LBD 基因 PCR 扩增结果Fig. 1 PCR product of ERa LBD fragenent 1. DL2000 marker; 2. PCR product of ERa2.2 表达载体pBind-ERa LBD的构建ERa LBD基因的PCR产物

15、经过胶回收与pGEM-T-easy载体进行连接构 建成pGEM-T-ERa-LBD克隆载体.该载体用Kpn I、BamH I的双酶切的验证 的阳性克隆载体(见Fig. 2)，进行测序。测序的结果与报道的序(NM_0011227 42) 一致。将 p GEM -T easy-ERa LBD，经 Kpn I、BamH I 双酶切切下的 ER a LBD基因片段与pBind promoter vector载体连接，构建表达载体。双酶切结 果(Fig. 2)证明表达质粒构建pBind - ERa (LBD)成功。图2 重组质粒的酶切分析Fig. 2 Restriction enzymatic anal

16、ysis of recombinant vector pGEM-T easy-ER a and pBind- ERa (LBD)1 : DL2000 marker ; 2 : pGEM-T easy-ER a (LBD) /KpnI， BamHI;3 : pBind 一 ERa (LBD) / Kpn I , BamH I ; 4 :入 DNA/Hind III marker2.3 模型的优化细胞的共转染效率受多种因素:脂质体的量、脂质体与DNA的比、报告质粒 与表达质粒之间的比例和宿主细胞等的影响。由于本实验室的其他核受体的筛选 模型已经针对转染的脂质体用量(0.5L/well),质粒DNA

17、量(0.3g/well) 做了前期的优化研究，所以研究在此基础上，针对本模型进一步进行报告质粒(本 室已构建)15和ER LBD表达质粒之间的比例和宿主细胞的优化。优化过程采 用1.5mol-L -1激动剂雌二醇作为阳性药,空白对照中加等量的DMSO作为阴 性对照。2.3.1 报告质粒与表达质粒转然用量的优化本研究在固定了每孔0.5u l脂质体的用量将报告质粒与表达质粒分别定设定为0.03 g/0.3 g ， 0.05 g/0.25 g ，0.15 g/0.15 g，0.25 g/0.15 g ， 0.3 g/0.03 g和0.3g/0.02g,共转染L02细胞24小时后测定荧光素酶的活性，结

18、果见Fig. 3。从结果看出报告质粒与表达质粒在0.3 g/0.03 g 时，荧光素酶的活性倍增 数最高，达18.27倍，高于其它几组，说明该条件下的模型最为灵敏。所以本模型的转染时每孔报告质粒与表达质粒分别确定为0.3g和0.03m go00.03/0.30.05/0.250.15/0.150.25/0.050.3/0.030.3/0.02the mass ratios of the repo rter vec tor to the express vec to r(“g/“g)uT -图3不同质粒比对转染效率的影响Fig. 3 The effects of different mass r

19、atios of the reporter vector to the expression vector ontransfection efficency.2.3.2 转染宿主的优选 由于不同的细胞株对转染效率有很大的影响，为了达到最佳的转染条件，本模型分别利用HCT-15、3T3L1、L02以及Hela四个细胞株进行宿主筛选。以1.5M molL -1激动剂雌二醇作为阳性药,结果见Fig. 4。该种转染条件在四个细胞株 中均可得到较好的转染效果,相比而言 L02 细胞系中诱导表达倍增数最高,3T3L1细胞系与Hela细胞系其次,HCT-15细胞系最低。选用L02细胞系不仅有较 好的转染效率

20、，而且它作为人体正常细胞可以完成对化合物细胞毒性的初步筛 选。HCT153T3L1L02HelaCell lines图4转染宿主的筛选结果Fig. 4 The effects of indifferent cell lines on transfection efficency2.3.2 模型的384孔微量化研究 此外，验证模型的稳定性和提高筛选效率并降低筛选成本，本研究还进行 了模型的微量化试验。，利用以上优化好的条件，按照脂质体、报告质粒、表达质粒与细胞培养板孔径面积等比下降的方式，对该模型进行微量化试验。结果见Fig. 5。1/2面积96孔板和384孔板与均有较好的筛选效果，证明该模型可

21、用于384 孔的微量化筛选。5O384孔板0.5面积96孔板96孔板different types of cell culture plate3052O25nolrcudnldlr0图5筛选模型的微量化结果Fig. 5 Results of miniaturization of HTS assays2.4 模型验证利用以上优化好的转染条件:0.5|J L/well的脂质体,0.3g/well报告质粒 与0.03g/well表达质粒分别共转染L02细胞系。本研究分别利用不同浓度的激 动剂阳性药雌二醇和拮抗剂阳性药它莫昔芬进行模型的验证。激动剂阳性药雌二 醇浓度分别选取40.79mol-L -i,

22、 13.47mol-L -1,4.48mol-L -1 ,1.5mol-L -1 ,0.5 mol-L -1, 0.17n mol-L -1,56.67 n mol-L -1 和 18.89 p mol-L -1 刺激细胞。拮抗剂阳性 药它莫昔芬浓度分别为 17.74m mol-L -1, 5.91m mol-L -1, 1.97m mol-L -1 0.66m molL -1, 0.22m mol-L -1, 73ymol-L-1, 24.33ymol-L-1 和8.llpmol-L-1 刺激细胞,结果见Fig. 6。阳性药在一定的浓度范围对ERa的激活都呈较好的浓度依赖关系。激动剂阳 性雌

23、二醇在1.5 mol-L -1 的浓度时激动活性高,荧光素酶活性的倍增25倍,拮抗 剂阳性药它莫昔芬在0.66m mol-L -1的浓度时拮抗效果最好，并且加药量与倍增数 有很好的量效关系。947381.I3gT5larnocarnc图6ERa激动剂和拮抗剂药物对模型的验证A.雌二醇estradiol B.它莫昔芬tamoxifenFig. 6 The effects of agonist and antiagonist drugs on transfection activities3 讨论本研究利用的单杂交技术是将核受体的配体结合结构域 (LBD) 与酵母细胞 转录因子GAL4的DNA结合

24、结构域(DBD)融合成嵌合蛋白表达质粒，再与含有 GAL4特异的响应元件的报告质粒共转染，通过测定报告基因的表达水平从而评 价核受体配体的激动或拮抗活性。该方法因为哺乳动物细胞没有酵母的 GAL4， 所以不存在内源性核受体的之间的相互干扰和交叉效应，所以本模型较以 ERE 为报告质粒的模型15的具有干扰少和背景低的优点。本研究通过对共转染质粒DNA量、报告质粒和表达质粒比例、转然宿主和 阳性药浓度等多种条件优化,，建立了一种96孔板的高通量ER配体调节剂的筛选 模型，该模型具有高的信躁比。而且通过对该方法的进行的1/2面积96孔板、 384 孔板的微量化试验进一步证明该方法的稳定性。激动剂和拮

25、抗剂的阳性对照药物 在本模型上有很好的浓度依赖关系,说明该模型较好的灵敏度。雌激素受体(Estrogen Receptor ER)是类固醇激素受体超家族的成员之一，对 体内的多种生理功能具有重要的调节作用16171轧该方法的建立为发现新的雌ER a调节剂，从而用于ER机理研究和药物开发，打下了坚实的基础。而且本研究 的模型已经用于大量的天然来源和合成化合物的样品筛选，并得到了多个结构和 活性多样的配体调节剂，将在今后的文章中陆续进行报道。参考文献1 Green S. ,Walter P. ,Kumar V. ,et al. Human oestrogen receptor cDNA:seque

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