抗结核分支杆菌药物筛选模型

《抗结核分支杆菌药物筛选模型》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗结核分支杆菌药物筛选模型（7页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、姓名：张俊 学号：S1170850新型抗结核分枝杆菌药物筛选模型摘要：结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，世界卫生组织报告显示，全球有20亿人感染结核分枝杆菌，其中会有十分之一的人会发展成结核病。结核病已成为仅次于艾滋病的第二大传染性疾病。近年来结核病发病呈逐年攀登趋势，目前多重耐药结核分枝杆菌的出现以及结核分枝杆菌在患者体内的持留状态已经成为结核病预防和治疗过程中的重大障碍，因此寻找新的药物作用靶点，建立新的药物筛选模型成为开发新型抗结核药物的关键。此综述介绍了新型的抗结核药物筛选模型，并说明模型的建立方法。关键词：结核病，抗结核药物，耐多药结核病，筛选模型Abstract: Tuber

2、culosis is a infectious disease caused by Mycobacterium, as the World Health Organization report , 20 million people worldwide infected with Mycobacterium tuberculosis , there will be one tenth of the people will develop TB. Second only to AIDS, tuberculosis has become the second largest infectious

3、diseases. In recent years, the trend of TB incidence was gradually increasing; the emergence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis has become the major obstacles of the tuberculosis prevention and treatment. Searching the new drug targets, establishing a new drug screening model becomes

4、the key to the development of new anti-TB drugs. This review describes the new anti-TB drug screening model and explains the model approach. Keywords: tuberculosis, anti-TB drugs, MDR-TB, screening model结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，主要侵犯肺脏，因此称为肺结核病。结核病又称为痨病和白色瘟疫，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。人与人之间呼吸道传

5、播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。结核病可以分为原发性肺结核、血行播散型肺结核、继发性肺结核和结核性胸膜炎。解放后人们的生活水平不断提高，结核已基本控制，随着环境污染和艾滋病的传播，以及耐药结核分枝杆菌的出现，结核病又卷土重来，发病率愈演愈烈。全球有20亿人感染结核分枝杆菌，其中会有十分之一的人会发展成结核病其中三分之一是处于潜伏感染状态12。一、抗结核药物1、 抗结核药物的历史上世纪40年代，链霉素（SM）和对氨基水杨酸钠（PAS）先后发现，而SM+PAS疗效优于单一用药，并可以预防结核分枝杆菌产生耐药性3。异烟肼（INH）发现后，INH+PAS联用的优势得到证实4。19

6、52年“三联疗法”（SM+INH+PAS）产生，疗程为18到24个月，并可视情况将PAS替换为乙胺丁醇（EMB）或氨硫脲（TB）56。1965年利福平（RFP）用于临床，并证实INH和RFP能够缩短疗程至九个月；后来，吡嗪酰胺（PZA）与上述药物联用可缩短疗程至6个月7。但是至今近40年来却没有发现一个全新结构的TB药物。2、 抗结核药物的现状目前，临床应用的TB药物分为一线和二线药物8，前者有RFP、INH、EMB、PZA等；后者有阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、丙硫异烟胺、环丝氨酸、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等。3、 新型抗结核药物研发的必要性和紧迫性（1）40余年来没有一个新的高校抗结

7、核药物问世；（2）艾滋病流行、结核病疫情回升、耐多药结核病例增多;（3）可根除结核病的新型疫苗目前处于研究阶段；（4）现有的抗结核药物不能解决结核持留性的问题，而持留菌是结核病复燃和复发的常见原因。4、 新型抗结核药物的目标9（1）缩短疗程至1到2月，或将DOTS中的药物数量和剂量明显减少；（2）对耐多药结核病有效，且无交叉耐药；（3）对结核潜伏感染提供更有效的治疗效果。二、耐多药结核病1、耐多药结核病耐多药结核病是指患者感染的结核杆菌在体外证实对异烟肼和利福平耐药，而极度耐药结核菌指患者在耐多药的基础上，还对6种主要抗结核药物中的三种以上的二线抗结核药耐药。2、耐药结核产生的原因 耐药结核病

8、根据其产生原因的不同可以分为两种：原发性耐药和获得性耐药。原发性耐药是指没有接受过抗结核药物治疗而发生结核分枝杆菌耐药，有既往抗结核治疗史的耐药结核患者称为获得性耐药。三、药靶发现新方法1、基因组学与药靶发现10：迄今为止，结核杆菌复合群中已有3个的全序列被测定，他们分别含有4410 (+-01)碱基对，约4000个编码蛋白质的基因和50个编码稳定的RNA基因。对于H37Rv来说，用生物信息学分析法，已准确预测出40%的基因的功能，另有20%的基因已经知道它们的部分功能，而剩下的40%的基因的功能完全未知，根据它们的生物学功能或者与已知药靶的相似功能就可以发现潜在的药物靶位。那些为分枝杆菌特有

9、的基因，可以成为专门针对分枝杆菌的新型药靶。相反，大量的和其他种属功能相似的基因，即保留性基因，可作为光谱抗生素的候选。由于人类基因组的序列已可获得，可以排除与人体同源的基因和蛋白质，防止药物同时作用于细菌和人体，从而减少副作用的发生。药物候选也可以增加特异性，去除大多数光谱抗生素不加选择地破坏肠道菌丛的副作用。2、比较基因组学与药靶发现：麻风分枝杆菌与结核分枝杆菌都具有包内寄生、生长缓慢的特征，且麻风分枝杆菌基因组约3.72Mb，比结核分枝杆菌小得多，它共有1605个蛋白质编码基因，约占基因组的49.5%，显示麻风分枝杆菌正在进行缩减性消亡。麻风分枝杆菌约有27%为假基因，即有1114个是不

10、活动的阅读框架，但在结核分枝杆菌的对应部分仍有功能。剩余的23.5%的 基因组为非编码基因，可能是没有功能的。通过对结核和麻风的基因和蛋白进行比较，发现它们共同具有1433个蛋白质，除去和其他原核生物、真核生物相同的蛋白质后，只剩下219个蛋白质。由于分枝杆菌在人体内需要相同的微环境、遭遇相同的生理学压力和免疫反应，这些基因产物具有特殊的功能，在分枝杆菌的胞内生长具有重要作用。这些蛋白质可以成为新型药物靶位的候选。通过和麻风分枝杆菌基因组比较，结核分枝杆菌只有Rv0462和麻风分枝杆菌对立，其余4个在麻风分枝杆菌中均为假基因，因此研究工作可集中在Rv0462就可以了，这就为研究者节省了大量时间

11、11。3、结核杆菌体内作用机制和药靶发现：早在1950年，Segal12就做了结核菌在体内外生长的对比研究。这些研究提供了令人信服的生化证据，即结核菌的自然感染状态与在人工培养基上的生长是不相同的。Segal观察到细菌在体内外使用的碳源是截然不同，在体外生长时倾向于使用糖类作为碳源，在体内生长时倾向于使用脂肪酸作为碳源。这一现象的遗传学基础已被分子生物学证实，即异柠檬酸裂合酶（ICL），它是脂肪酸代谢中的关建酶。可以将ICL的抑制物作为潜在的治疗药物，但在传统的方法中筛选抗结核药物时，以ICL为靶位的药物被错过了，因为ICL在体外标准培养基中生长时并不是必须的。四、抗结核药物筛选模型1、ICL

12、抑制剂酶水平筛选模型1.1、原理致病性菌株结核分枝杆菌H37Rv全基因组测序工作的完成，为研究新型抗结核药物提供了大量的药物靶点13。ICL作为乙醛酸途径的关建酶，当培养基的碳源受到限制或者缺氧时，菌体内糖酵解途径减弱，乙醛酸循环加强，酶活性上调。ICL对结核分枝杆菌在巨噬细胞内的持续存活至关重要。乙醛酸途径存在于原核生物、低等真核生物和植物中，在哺乳动物体内不存在14，故可将ICL作为特异性较强的药物靶点，建立新型抗结核分枝杆菌药物的筛选模型15。1.2、方法(1)结核分枝杆菌H37RvICL基因的克隆(2)重组ICL的表达与纯化(3)重组ICL活性检测及动力学参数测定(4)ICL抑制剂酶水

13、平筛选模型的建立(5)乙醛酸途径抑制剂细胞水平筛选模型的建立1.3、结果与讨论以异柠檬酸裂解酶作为靶点筛选得到的抗结核药物不仅可以有效杀灭处于持留状态的结核分枝杆菌，缩短结核病治疗疗程，同时由于哺乳动物体内不存在乙醛酸循环，因此以ICL为靶点开发的新药毒副作用较小。方法中针对ICL为靶点，先在酶分子水平后在菌体细胞水平建立筛选模型，不仅是对样品活性的验证，还使筛选模型更接近于持留状态的结核分枝杆菌，筛选结果更具有真实性、可靠性。2、以蛋白激酶G为靶点的筛选模型2.1、原理结核分枝杆菌在被巨噬细胞吞噬，形成噬体后，可以通过阻碍吞噬体的成熟及其与溶酶体的融合，而使其自身不被溶酶体酶降解，从而在巨噬

14、细胞内长期存留下来16。此时的细菌代谢活动降至最低，生长繁殖几乎停止，不易被抗菌药物杀灭，这种类似于休眠的长期存活状态被称为“持留”状态。当机体免疫力下降时，持留状态的细菌又可以继续生长繁殖，恢复致病力。持留状态形成的原因很复杂，涉及多方面机制。其中，结核分枝杆菌分泌的蛋白激酶G-一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶对于持留状态的形成和维护有重要作用17-19。因此可以通过建立酶水平的筛选模型来筛选有效的蛋白激酶G抑制剂，为今后开发真正有效抑制持留菌的抗结核新药奠定基础。2.2、方法2.2.1结核分枝杆菌蛋白激酶G基因原核重组质粒的构建及其表达(1)蛋白激酶G基因的体外扩增(2)Pet30b-蛋白激酶G

15、表达载体的构建(3)蛋白激酶G基因在大肠杆菌中的表达及蛋白激酶G蛋白的纯化2.2.2重组蛋白激酶G酶活性的测定2.2.3重组蛋白激酶G的酶学性质测定(1)最适反应温度的测定(2)最适pH的测定(3)反应速度与酶浓度的关系测定(4)最适反应时间的测定(5)反应动力参数的测定2.2.4筛选模型的建立与应用(1)计算筛选模型的信噪比，并对模型进行可行性分析(2)对待测样品进行前处理(3)测定待测样品对蛋白激酶G的抑制作用(4)计算抑制率(5)排除假阳性结果(6)利用MIT法检测阳性药物对细胞存活的影响2.3结果与讨论结核分枝杆菌的蛋白激酶G具有自我磷酸化的功能，它可以催化ATP上的磷酸基团添加到蛋白

16、激酶G自身的丝氨酸/苏氨酸残基上使之磷酸化，并生成ADP20。生成的ADP可与磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶催化下生成丙酮酸，而生成的丙酮酸又可以在乳酸脱氢酶催化下转变为乳酸，此步骤伴随着还原态的NADH转变为氧化态的NAD+。由于还原态NADH的最大光吸收峰在340nm，而氧化态的NAD+的最大光吸收峰在280nm，伴随着NADH到NAD+这一步反应的进行，反应体系在340nm波长下的光吸收值会大大降低21。本方法中涉及蛋白激酶G、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶工三个酶，待测样品对其中任一种酶有抑制作用均可导致最后一步反应NADH向NAD+的转变受阻而使得反应体系的OD340值不下降，因此利用假阳性排

17、除法可以排除由后两个酶抑制剂造成的假阳性。从而证明待测样品对蛋白激酶G具有抑制作用，为真正开发出抑制持留菌的抗结核新药打下基础。3、以硅片结构为基础的筛选模型223.1原理抗结核的治疗方法普遍为抗生素的混合使用，包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素23。异烟肼对杀灭分枝杆菌具有积极作用，并且其具有高度的针对性，对于其他微生物无效。然而异烟肼只对迅速分裂的分枝杆菌具有杀菌治疗作用。众所周知，异烟肼是一种前体药物，在体内需要过氧化氢酶的激活。一旦异烟肼被激活，它与NAD+形成一个共价键，并且抑制烯酰-酰基载体蛋白还原酶，这一蛋白还原酶对霉酸菌的生成至关重要24。霉酸菌是结核分枝杆菌细胞壁

18、的重要组成部分，因此异烟肼可以通过抑制霉酸菌的生长来杀死快速分裂的结核分枝杆菌。基于这一理论，我们可以建立筛选模型，来找出烯酰-酰胺载体蛋白还原酶的抑制剂，继而抑制霉酸菌的生成，最后达到抑制结核分枝杆菌细胞壁生长的作用，继而杀死结核分枝杆菌。3.2方法(1)测定烯酰-酰基载体蛋白还原酶的三维结构(2)利用GOLD和DOCK两步筛选法进行筛选(3)找出适合的菌株中的活性化合物(4)确定菌株适合的生长条件(5)进行哺乳动物的毒性实验筛选过程示意图3.3结果与讨论结核分枝杆菌的烯酰-酰基载体蛋白还原酶是II型脂肪酸合成系统中的关键酶。它参与霉菌酸的产生，是抗结核药物异烟肼作用的靶点。因此可以利用这一

19、已知靶点来找出与异烟肼具有相同作用的作用于烯酰-酰基载体蛋白还原酶的新型抗生素抑制剂。同时在实验中采取的基于结构的药物筛选方法比传统的、试验型的药物筛选方法能更快地筛选出活性成分25-26。当目标蛋白质的晶体结构确定时可以利用分子虚拟对接方法和参照计算机数据库，使得筛选变得更加快捷。计算机辅助筛选使得筛选更加方便，准确度更高27。五、结论自第一个抗结核药物链霉素1942年被发现后，人类就一直在和结核分枝杆菌的抗药性赛跑。但与此相矛盾的是，在利福平被发现后四十多年中没有任何新的抗结核药物被批准应用于结核病临床治疗，为了应对日益严重的结核分枝杆菌耐药性问题，开发新的抗结核药物已经迫在眉睫。基因组学

20、和蛋白质组学等分子生物学技术的发展给抗结核新药的发现带来了前所未有的机遇。缩短疗程、对耐药菌有效、兼顾治疗潜伏性感染是研发的方向。随着更多的作用靶点的发现，越来越多的高效的筛选模型将会被建立，更多新型的抗结核药物将被用于临床，人类将会更早摆脱结核疾病的困扰。六、参考文献1 Dye C, Scheele S, Dolin P, et al. Consensus statement. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveil

21、lance and Monitoring Project. J Am Med Assoc, 1999, 282(7): 677686.2 Parrish NM, Dick JD, Bishai WR. Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbial, 1998(6): 107112.3 van den Boogaard J, Kibiki G S, Kisanga E R, et al. New drugs against tuberculosis: problems, progress, and ev

22、aluation of agents in clinical development J. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53 (3): 849-862.4 Treatment of pulmonary tuberculosis with isoniazid: a Medical Research Council investigation J. Br Med J, 1952, 2 (4787): 735-746.5 Iseman M D. Tuberculosis therapy: past, present and futureJ. Eur Resp

23、ir J, 2002, 20 (S36): 87s-94s.6 Chhabria M, Jani M，Patel S. New frontiers in the therapy of tuberculosis: fi ghting with the global menaceJ. Mini Rev Med Chem, 2009, 9 (4): 401-430.7 Gutierrez-Lugo M T, Bewley C A. Natural products, small molecules, and genetics in tuberculosis drug developmentJ. J

24、Med Chem, 2008, 51 (9): 2606- 26128 陆宇, 段连山. 抗结核药物的研究进展和发展趋势J. 中国抗生素杂志, 2005, 30 (4): 250-253.9 Scientific blueprlnt for TB drug development，the Global Alliance for TB Drug Development forumEBOLhttp：10 Cole STComparative mycobacterial genomics as a tool for drug target and antigen discoveryJEta Resp

25、ir J，2009，(S)：36，78-8611 McKinney JDIn vivo veritas：the search for TB drug targets goes liveJNature Medicine，2009，6(12)：1330-133412 Segal W Bloch HBiochemical diferentiation of Myo bacterium tub erculosisgrown in vivo and in vitroJJ Beteriol，1956，72：132-14113 Cole ST，Brosch R,Parkhill J,et al,Deciph

26、ering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequenceJ Nature， 1998， 393( 6685) : 537-54414 王旸，肖春玲 以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物J 中国抗生素杂志，2007，32( 7) : 391-39515 赖煦卉，王洪海，张雪莲 异柠檬酸裂解酶新型抗结核药物靶标J 中国感染控制杂志，2008，7 ( 5) : 359-36216 Flynn JL, Chan J. Immunology of tuberculosis. Annu R

27、evImmunol, 2009(19): 93129.17 Walburger A, Koul A, Ferrari G, et al. Protein kinase G from pathogenic mycobacteria promotes survival within macrophages. Science, 2004(304): 18001804.18 Szkely R, Wczek F, Szabadkai I, et al. A novel drug discovery concept for tuberculosis: inhibition of bacterial and

28、 host cell signaling. Immunol Lett, 2008, 116(2): 225231.19 Hegymegi-Barakonyi B, Szkely R, Varga Z, et al. Signalling inhibitors against Mycobacterium tuberculosis-early days of a new therapeutic concept in tuberculosis.Curr Med Chem, 2008, 15(26): 27602770.20Scherr N, Mller P, Perisa D, et al. Sur

29、vival of pathogenic mycobacteria in macrophages is mediated through autophosphorylation of protein kinase G. J Bacteriol, 2009, 191(14): 45464554.21龚立康. 以泛酸合成酶为靶点的抗结核药物筛选模型的建立和应用. 中国协和医科大学硕士学位论文, 2006.22 Yuya Izumizono, Shiho Arevalo, Yuji Koseki, Masato Kuroki, Shunsuke Aoki*Identification of novel

30、 potential antibiotics for tuberculosis by in silicostructure-based drug screening European Journal of Medicinal Chemistry 46 (2011) 1849-185623 E.K. Schroeder, N. de Souza, D.S. Santos, J.S. Blanchard, L.A. Basso, Drugs that inhibit mycolic acid biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis, Curr. Pha

31、rm. Biotechnol. 3 (2002) 197-225. 24 R.S. Magliozzo, J.A. Marcinkevicience, Evidence for isoniazid oxidation by oxyferrous mycobacterial catalase-peroxidase, J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 11303-11304.25 N. Sunduru, L. Gupta, V. Chaturvedi, R. Dwivedi, S. Sinha, P.M.S. Chauhan, Discovery of new 1,3,5-

32、triazine scaffolds with potent activity against Mycobacteriumtuberculosis H37Rv, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 3335-3345.26 K. Hirayama, S. Aoki, K. Nishikawa, T. Matsumoto, K. Wada, Identification ofnovel chemical inhibitors for ubiquitin C-terminal hydrolase-L3 by virtual screening, Bioorg. Med. Chem. 15 (2007) 6810-6818.27 M.A. Miteva, W.H. Lee, M.O. Montes, B.O. Villoutreix, Fast structure-basedvirtual ligand screening combining FRED, DOCK, and Surflex, J. Med. Chem. 48 (2005) 6012-6022