圆二色谱仪课件

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1、2022-11-26CD/ORD发展历史 1961 Cary Model 60 Spectropolarimeter,Jasco AP-1 1963 Jasco ORD/UV5 1960-1965 Jobin-Yvon CD Cary 61CD Jasco ORD/UV5-CD 1969 Cary 1401CD 1970 Jasco J-20 1972 Jasco J-40 CD/ORD 1978 Jasco J-500 1980 J-200 1983 Bio-Logic 400 1986 J-600 1990 Jasco J-700CD,Jabin-Yvon CD6,AVIV 410(Car

2、y 60)1999 Jasco J-810 Bio-Logic MOS-450 2003 APP ChiraScan 2005 Jasco J-815 2006 APP ChiraScan Plus 2007 AVIV Model 420 2013 new Bio-Logic MOS-500 newJasco J-1500 2022-11-262022-11-262022-11-26圆二色 Circular Dichroism对左旋和右旋圆偏光的吸收不同，形成椭圆偏振光对左旋和右旋圆偏光的吸收不同，形成椭圆偏振光2022-11-262022-11-26-螺旋-Helix-折叠-Sheet-转角

3、-Turnpoly(Pro)II无规则卷曲Random2022-11-26-band(nm)+band(nm)-螺旋-Helix 222，208192-折叠-Sheet 216195-转角-Turn220-230(弱)180-190(强)205左手螺旋P2结构poly(Pro)II190210-230(弱)无规则卷曲Random2002122022-11-26-120-70-203080Elip./deg cm2 decimol-1-505190200210220230240wavenumber/nmResidueof Elip.-Helix-SheetTurnRandom-helix:41%

4、-Sheet:15%Turn:23%Random:21%2022-11-26蛋白质近紫外蛋白质近紫外CD 表征三级结构信息表征三级结构信息蛋白质中芳香氨基酸残基,如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区260320nm，表现出CD 信号。研究表明：色氨酸在290 及305nm 处有精细的特征CD 峰；酪氨酸在275nm 及282nm 有CD 峰；苯丙氨酸在255、260 及270 nm 有弱尖锐的峰2022-11-262022-11-262022-11-262022-11-262022-11-262022-11-26Bio-Logic MO

5、S-500Jasco J1500APL Chirascan2022-11-262022-11-26 C CD DM ME E-r ra ay yO O-r ra ay yS SH H1 10 0L LS SBio-Logic MOS-500Jasco J-1500光源光源150W150W2022-11-26光柵-稜鏡 就色散而言，光栅的性能较优于棱镜 第一，由分辨本领知，光栅可经由增加光栅数或观察光栅的高级谱线(较大之p值)来增大其分辨本领；而棱镜只有增大棱镜一个方法来增大，这是光栅优于棱镜的一点。第二，用棱镜分光时，因为色散是和波长的三次方成反比，所以实际上所看到的相同波长间隔的光谱区域并不

6、相等，而是长波长的光谱区域较短，短波长的光谱区域较长。用光栅分光时，因为光栅方程式示出绕射角与入射光的波长成正比，所以，所看到的相同波长间隔的光谱区域大致相等，这是光栅优于棱镜的第二点。第三，就光谱而言，对于宽度相同的入射缝，光栅形成的谱线较明亮，易于观察。根据上面从色散的观点所讨论知道，光栅在这方面较优于棱镜，而这也是光栅分光仪较常被使用的原因。2022-11-262022-11-26-operation in NIR calls for very narrow slits-large bandpasses are not possible in the low UV since slitw

7、idth is mechanically limited to 2 or 3 mmJasco J-800 to keep constant 1 nm bandwidth*,following slitwidths(nm)slitwidth(mm)900 0.011 800 0.013 700 0.019 600 0.027 500 0.053 400 0.104 300 0.278 250 0.538 200 1.344 170 2.770狭缝宽度Bio-Logic MOS-500 to keep constant 1nm bandwidth Slitwidth always 2mm,from

8、 163nm to 1250nm2022-11-26Jasco CD 狭缝校准 2022-11-26Jasco CD 波长校准2022-11-26Jasco CD 圆二色椭圆度校准 2022-11-26光源:三种光源 (Xe/Hg-Xe/钨丝灯)设计Xe光谱扫描用(130175 W),W 波长500nm以上用,Hg-Xe 停流或变温检测用Cathode adaptorLight source cover Anode holderLight source M mirrorM mirror01(150W Light source)Bio-Logic MOS-500Jasco CD单光源设计2022

9、-11-262022-11-2617518018519019520020521020040060080010001200Walelength(nm)PMT high voltage(V)氮气吹扫Bio-Logic MOS-500 185nm以下3升/min.185nm以上不需氮气吹扫 Jasco&APL CD 3-10L/min溶剂内含物建议清洗方法水溶液蛋白质 DNA 生物制剂含洗涤剂温水浸泡、稀酸润冲再大量纯水冲洗。水溶液盐溶液温水、酸清洗、大量水依次冲洗。水溶液碱性溶液含洗涤剂温水浸泡、稀酸、大量水依次冲洗。有机溶液油性基质溶剂，含洗涤剂温水，稀酸清洗，大量水冲洗有机溶液酒精溶液溶剂清洗

10、，大量水依次冲洗有机溶液酸性溶液溶剂清洗，大量水依次冲洗有机溶液碱性溶液溶剂，稀酸清洗，大量水依次冲洗比色池清洗建议1 如何清洗比色池:需要确定比色池上污染物类型。下表中列出了一些清洗建议：荧光测量：使用5M硝酸清洗比色池，使用前用大量水冲洗。稀酸：2M稀盐酸或2M稀硝酸,酸：5M盐酸或5M硝酸,溶剂清洗：使用对样品溶解力最强的溶液清洗大量水清洗：使用至少10倍的纯水（包括去离子水，蒸馏水或RO）清洗清洁剂：如果可以使用中性清洁剂，使用后，用稀酸，大量水将清洁剂清洁干净2 注意事项：保持比色池清洁干净是比色池可长时间有效使用的最重要因素之一。日常工作时，永远不可以令比色池处于干燥状态。在使用间

11、隔期间，如将比色池置于水或有机溶液中，比色池就不会变干或者粘附。只可以使用镜头清洁纸或细布擦拭光学配件表面，大多数的纸制品都含有木纤维，会刮伤会损坏比色池界面或表面。日常工作结束以后，一定要将比色池清洗干净，变干后放置在合适的容器中。3 特殊情况 5M硝酸：不可以用于清洗具有抗反射或具有镜面涂层的比色池 超声波清洗器：不建议使用超声波清洗器清洁比色池。每个清洗器都有不同的频率，如果清洗器同比色池产生共振，就会毁坏比色池。CD(圆二色光谱仪)样品的前处理 在测量CD以前先测量一般UV/VIS吸收光谱。CD光谱的需求与UV/VIS一样：在0.5-1.0吸收值范围内的讯号会有最好讯杂比。通常样品与溶

12、剂吸收值和大于2 O.D.时将会很困难得到正确的数据。实际上在低波长UV扫描很困难得到正确吸收值。大部份现今光谱仪都限制在190nm以上，因此任何一次低于200nm以下测定将会是个问题。所以通常会建议直接使用CD光谱仪来做吸收光谱测量。选择合适的缓冲液 在CD测定时选择合适的缓冲液是非常重要。缓冲液必需尽量透明。大部份有意思的结构信息被发现在低波长UV。这个波段也是一些缓冲液具有高吸收值会遮蔽CD讯号。对大部分工作而言10mM 磷酸钾是一个很好的选择。我们可以用适当比例的KH2PO4及K2HPO4混合达到我们想要的pH值。千万不可以用HCl来调整pH。在低UV波段氯离子会严重干扰CD测定。如果

13、有需要辅助离子时不要使用NaCl，可以用Na2SO4或NaF。比色池光径选择合适光径的CD比色池对于解决溶剂吸收问题将会非常有帮助。小一点光径(如：0.1mm或0.05mm)液槽可以明显降低溶剂吸收并且可容许扫瞄到低波长。而这些液槽必需使用较高浓度的蛋白质，如约1mg/ml。2022-11-26CDTypical Conditions for protein CDProtein Concentration:0.1 mg/ml(or 1mg/ml)Cell Path Length:1 mm(0.1mm)Volume 200 l(20l)Need very little sample 0.02 m

14、g(0.02 mg)Buffer Concentration:5 mM as low as possibleSacn speed:30nm/min.Band width:1nm Bio-Logic MOS-5002022-11-262022-11-262022-11-26Wavelength(nm)190200210220230240250MilliDegree-25-20-15-10-50510152025MOS-500 Cuvette:1 mm quartz cuvette.Chemical used:Hen egg lysosyme:0.1 and 0.2mg/ml in water.B

15、and width:2nm Sacn speed:30nm/min.CDCuvette英国Starna圆二色光谱仪专用比色池圆二色光谱测量时用长方形比色池即可,测量旋光色散谱时采用圆形比色池为佳但也可使用方形比色池TypeNo.材质光径mm内部宽度mm外部尺寸mm容积Vol.ml长宽高1or 21Q,I,1103.512.5450.400/0.2751Q,I,2104.512.5450.700/0.451Q,I,5107.512.5451.700/1.21Q,I,101012.512.5453.500/2.5英国Starna圆二色光谱仪专用比色池TypeNo.材质光径mm内径mm外部mm体积V

16、ol.ml直径长度31/BQ0.01132222.50.14031/BQ0.05132222.50.15131/BQ0.10132222.50.16531/BQ0.20132222.50.19431/BQ0.50132222.50.27831/BQ1132222.50.42031/BQ2132222.50.70331/BQ5132222.51.552英国Starna圆二色光谱仪专用比色池TypeNo.材质光径mm样品仓mm外部尺寸mm容积Vol.ml宽长高宽长高20/CQ,I0.0180.013812.52.5450.00320/CQ,I0.0880.083812.52.5450.02420/

17、CQ,I0.180.13812.52.6450.03020/CQ,I0.280.23812.52.7450.06020/CQ,I0.580.53812.53.0450.150英国Starna圆二色光谱仪专用比色池可拆卸式比色池,光程最短可至0.01mm,样品只需3uLTypeNo.材质光径mm外部尺寸mm容积mlRemarks宽长高3/MS Q1012.512.5453.5标准荧光池9-F/MSQ1012.512.5451.8半微量荧光池18-F/MSQ1012.512.5450.9微量荧光池23-F/MSQ1012.512.5483.5标准荧光池，带密封塞29-F/MSQ1012.512.5

18、481.8半微量荧光池，带密封塞英国Starna圆二色光谱仪专用比色池变温实验用搅拌池SolventUseable short wavelength Limit(nm)Remarks1cm cell1mm cell0.1mm celln-hexane210183180Nonpolar,small solubilityCyclohexane210185180Nonpolar,small solubilityIsooctane210185180Nonpolar,small solubilityDioxane220210202Nonpolar,commonly used for organic cm

19、poundsBenzene280275270Nonpolar,sometimes used in the measurement of symthetic polymersCarbon tetrachloride250240230Nonpolar,special in OERCDChloroform240230220Intermediate polarity,used in comperison eith NMR data1,2-dichloroethane220210200Nonpolar,high solubilityMethanol210195185Polar,commonly used

20、 for organic compoundsEthanol210195185Polar,frequently used for organic compoundsTrifluoroacetic acid260250240Measurement of synthetic polymers,corrosiveDimethylsulfoxide264252245Used in the measurement of synthetic polymersTetrahydrofuran220210204Used in the measurement of synthetic polymerst-decal

21、in220Solvent for high temperature measurement(bp+194.6)不同溶剂在不同光程比色池的截止波长表SolventUsable short wavelength limit(nm)1cm cell1mm cell0.1mm cellEthanol/methanol(4:1)210nm200nmDistilled water185nm180nm175nm10mM Sodium phosphate182nm0.1M Sodium phosphate190nm0.1M Sodium chloride195nm0.1Mtris-HCl 200nm0.1M

22、Ammonium citrate220nm不同溶剂在不同光程比色池的截止波长表SolventShort-wavelength limit(nm)Path-length of cell1mm0.2mm0.1mm0.05mmDistilled water180nm176nm175nm174nmHeavy water(for NMR,99.75%)175nm172nm171nm170nmn-Hexane(for fluorescence)172nm169nm168nmTrifluoroethano;(for NMR,99.5%)177nm170nm不同溶剂在不同光程比色池的截止波长表2022-11-

23、26How to Select Parameters波长测量范围选择波长测量范围选择:先用圆二色光谱仪测量来测量待测样品的紫外光谱,圆二色光谱的波长检测范围可设在有紫外吸收波段两端再各加50-100nm2022-11-26Data acquisition intervals(resolution)In spectrum measurement Usually,about 0.2 nm will do.However,if the scanning speed is set at Step,about 1 nm is appropriate.Make the resolution coarse

24、if spectrum peaks are broad or fine if sharp.2022-11-26The scanning speed must be changed according to response.Usually,set the scanning speed at 20 to 100 nm/min and response at 0.25 to 2 sec in measurement.Scanning speed(nm/min)Response(recommended)Higher limit100001.0 to 2.0 msec32.0 msec50002.0

25、to 4.0 msec64.0 msec20004.0 to 8.0 msec0.25 sec100032.0 msec to 0.125 sec0.5 sec50064.0 msec to 0.25 sec1.0 sec2000.125 to 0.5 sec2.0 sec1000.25 to 1.0 sec4.0 sec500.5 to 2.0 sec8.0 sec201.0 to 2.0 sec16.0 sec102.0 to 4.0 sec16.0 sec52.0 to 8.0 sec16.0 sec24.0 to 16.0 sec16.0 sec18.0 to 16.0 sec16.0

26、 sec扫描速度Scanning speed2022-11-26Sensitivity(CD mdeg/FS)No.of integration501-2204104-854-1628-32116-50No.of Integration and Sensitivity (Response 2 sec)Increasing the No.of integration improves signal-to-noise ratio of spectrum.2022-11-26Response to Obtain High Signal-to-Noise RatioCD sensitivity(mde

27、g/FS)Response(sec)10000.064-0.0255000.125-0.52000.125-0.51000.25-0.5500.25-1.0200.5-2.0100.5-8.051.0-16.02,14.0-16.0Total Integration Time=(W/Step+1)Response(W/Step+1):Number of data points2022-11-26Usually,set the band width at 1.0 nm before measurement.Decrease it in the measurement of a sharp spectrum such as MCD,or increase it in the measurement by a micro cell,when the signal-to-noise ratio is low.When a long wavelength detector(400 to 1100 nm)is used,increase the band widthBand width and slit width2022-11-26谢谢各位专家及领导